沙眼衣原体pORF5质粒蛋白经TLR2激活MAPK信号通路诱导THP-1细胞产生前炎症细胞因子

发布时间：2018-01-19 02:22

  本文关键词： 沙眼衣原体 质粒蛋白pORF5 丝裂原活化蛋白激酶 前炎症细胞因子　出处：《南华大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是引起沙眼、尿道炎和盆腔炎等疾病的重要病原菌，炎症反应过度所导致的免疫病理损伤是Ct致病的重要环节，但其确切的致病机制还不甚明了。本研究试图探讨Ct质粒蛋白pORF5能否诱导人单核细胞(THP-1)产生IL-8、IL-1β、TNF-α等前炎症因子(CKs)，以及与Toll样受体2（TLR2）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的关系，，为深入研究Ct的致病机制提供实验依据。 方法：将已构建好的pGEX-6p-1/pORF5重组质粒转化XL1-blue大肠杆菌，IPTG诱导表达GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B纯化，纯化的GST-pORF5融合蛋白再经PreScission Protease切割GST标签制备不含GST的pORF5靶蛋白，BCA法测定pORF5靶蛋白浓度，SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定靶蛋白。pORF5蛋白经去内毒素处理后，分别用2～8μg/mL的pORF5蛋白体外刺激经PMA处理的THP-1细胞，并于0h、6h、12h、24h、36h收集细胞，ELISA检测IL-8、IL-1β和TNF-α。Western blotting检测p38、JNK和ERK1/2的活化情况；分别用不同浓度（1、10、30μM）的ERK1/2特异性抑制剂PD98059、p38特异性抑制剂SB203580及TLR2抗体预处理THP-1细胞后，再以6μg/mL pORF5蛋白刺激12h，分析其对IL-8、IL-1β和TNF-α产生的影响。 结果: (1) pGEX-6p-1/pORF5重组质粒转化XL1-blue大肠杆菌后，IPTG诱导表达一分子量约54KD的GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白再经PreScission Protease蛋白酶切割GST标签后获得不含GST-tag的分子量约为28KD的pORF5蛋白，纯度可达95%以上。 (2)不同浓度的pORF5蛋白能明显诱导THP-1细胞产生IL-8、IL-1β和TNF-α，当pORF5蛋白浓度为2μg/mL～6μg/mL，CKs的产生水平与pORF5蛋白呈明显的剂量依赖性；当pORF5浓度高于6μg/mL时，IL-8、IL-1β和TNF-α产生水平减少；用6μg/mL的pORF5蛋白刺激THP-1细胞6h时，TNF-α量达到高峰，持续到12h后TNF-α水平逐渐下降，12h时IL-1β和IL-8量达到高峰。 (3) Western blotting结果显示，pORF5刺激THP-1细胞可活化ERK1/2/MAPK和p38/MAPK，其中ERK1/2途径在蛋白刺激THP-1细胞后的15min磷酸化水平达到高峰，p38途径在刺激细胞30min时磷酸化水平达到高峰，持续时间达60min以上，SAPK/JNK1/2未检测到磷酸化。 (4)通过使用不同浓度的p38、ERK1/2抑制剂后，ELISA结果显示IL-1β、IL-8和TNF-α产生水平均降低，呈剂量依赖性，在抑制剂浓度为30μM时，IL-8分别降至57%和58.8%，IL-1β分别降至22%和45%，TNF-α分别降至22.4%和16.3%。 (5) TLR2抗体预处理THP-1细胞30min后再用6μg/mL pORF5蛋白刺激THP-1细胞12h，IL-1β、IL-8和TNF-α产生水平与处理前相比，IL-1β、IL-8和TNF-α分别降低9.8%、32.7%和25.3%。 结论: (1) Ct pORF5蛋白可诱导THP-1细胞产生前炎症CKs：IL-8、IL-1β和TNF-α； (2) pORF5蛋白可激活p38/MAPK和ERK1/2/MAPK通路，活化的p38/MAPK和ERK1/2/MAPK通路通过TLR2参与pORF5诱导前炎症细胞因子IL-8、IL-1β和TNF-α的产生。
[Abstract]:Objective: Chlamydia trachomatisCtis is an important pathogen of trachoma, urethritis and pelvic inflammatory disease. The immune pathological damage caused by excessive inflammatory reaction is an important part of Ct pathogenicity. However, the exact pathogenicity of Ct plasmid protein pORF5 is still unclear. This study attempts to explore whether the Ct plasmid protein pORF5 can induce the production of IL-8 and IL-1 尾 in human mononuclear cells (THP-1). TNF- 伪 and other proinflammatory cytokines, and their relationship with Toll receptor 2 (TLR2) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway. To provide experimental basis for further study of pathogenesis of Ct. Methods: the constructed pGEX-6p-1/pORF5 recombinant plasmid was transformed into XL1-blue Escherichia coli to induce the expression of GST-pORF5 fusion protein. The fusion protein was purified by glutathione-agarose gel 4B. The purified GST-pORF5 fusion protein was then digested with PreScission Protease to prepare pORF5 target protein without GST. The concentration of pORF5 target protein was determined by BCA method. SDS-PAGE and Western blotting were used to identify the target protein .pORF5 protein after endotoxin removal. The THP-1 cells treated with PMA were stimulated with 2 渭 g / mL of pORF5 protein in vitro, and the cells were collected at 0 h, 6 h, 12 h, 24 h and 36 h, respectively. IL-8 IL-1 尾 and TNF- 伪. Western blotting were detected by ELISA to detect the activation of p38 JNK and ERK1/2. PD98059, a specific inhibitor of ERK1/2, was used at different concentrations of 10 ~ 10 ~ (30 渭 M). THP-1 cells were pretreated with p38 specific inhibitor SB203580 and TLR2 antibody, and then stimulated with 6 渭 g / mL pORF5 protein for 12 h. Effects of IL-1 尾 and TNF- 伪. Results: 1) the recombinant plasmid of pGEX-6p-1/pORF5 was transformed into E. coli XL1-blue. IPTG induced the expression of a 54KD GST-pORF5 fusion protein. The fusion protein was then digested with PreScission Protease protease to obtain a 28KD pORF5 protein with a molecular weight of about 28KD without GST-tag. Purity can reach more than 95%. (2) different concentrations of pORF5 protein could induce the production of IL-8 IL-1 尾 and TNF- 伪 in THP-1 cells. When the concentration of pORF5 protein was 2 渭 g / mL ~ 6 渭 g / mL ~ (-1), the production level of CKs was in a dose-dependent manner. When the concentration of pORF5 was higher than 6 渭 g / mL, the production levels of IL-1 尾 and TNF- 伪 decreased. The level of TNF- 伪 in THP-1 cells reached the peak at 6 h after stimulation with 6 渭 g / mL pORF5 protein, and decreased gradually after 12 h. The levels of IL-1 尾 and IL-8 reached the peak at 12 h. The results of Western blotting showed that pORF5-stimulated THP-1 cells could activate ERK1/2/MAPK and p38 / MAPK. The phosphorylation level of ERK1/2 pathway reached the peak at 15 minutes after stimulation of THP-1 cells by protein and the phosphorylation level of p38 pathway reached the peak at 30 minutes after stimulation of THP-1 cells. No phosphorylation was detected in SAPKR / JNK1 / 2 for more than 60 min. The results of Elisa showed that the production of IL-1 尾 -IL-8 and TNF- 伪 decreased in a dose-dependent manner. At the concentration of 30 渭 M, IL-8 decreased to 57% and 58. 8 渭 M, respectively. IL-1 尾 decreased to 22% and 45, respectively. TNF- 伪 decreased to 22.4% and 16.3a, respectively. THP-1 cells were pretreated with TLR2 antibody for 30 minutes and then stimulated with 6 渭 g / mL pORF5 protein for 12 h. The production levels of IL-8 and TNF- 伪 were significantly lower than those before treatment. The levels of IL-1 尾 IL-8 and TNF- 伪 were decreased by 9.8% and 25.3%, respectively. Conclusion: Ct pORF5 protein could induce THP-1 cells to produce pro-inflammatory CKS: IL-8 IL-1 尾 and TNF- 伪. 2) pORF5 protein can activate p38 / MAPK and ERK1/2/MAPK pathway. The activated p38 / MAPK and ERK1/2/MAPK pathway is involved in the production of IL-8 IL-1 尾 and TNF- 伪 by TLR2.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R374

【共引文献】

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本文编号：1442209