血小板源性生长因子在烟雾暴露大鼠肺血管重塑中的作用及其机制研究

发布时间：2018-01-19 15:32

本文关键词：血小板源性生长因子香烟烟雾肺动脉平滑肌血管肺血管重塑香烟烟雾血小板源性生长因子肺动脉平滑肌细胞增殖香烟烟雾血小板源性生长因子蛋白激酶C 肺动脉平滑肌　出处：《山西医科大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分烟雾暴露大鼠肺血管血小板源性生长因子的表达及其与肺血管重塑的关系目的观察烟雾暴露大鼠肺动脉形态学变化、压力变化及血小板源性生长因子(PDGFB/PD GFR-p)表达变化,探讨烟雾暴露致大鼠肺血管重塑中PDGFB/PDGFR-β的表达变化及其意义。方法 40只雄性SD大鼠随机分为对照组(C组)、烟雾暴露1月组(S1m)、烟雾暴露2月组(S2m)、烟雾暴露3月组(S3m),建立烟雾暴露大鼠模型,检测各组大鼠动脉血氧分压(Pa02)、平均右心室收缩压(mRVSP)、右心室肥厚指数(RVHI),HE染色观察肺动脉组织学改变并测量肺小动脉管壁面积/管总面积(WA%),Masson染色检测肺动脉壁胶原增殖,透射电镜观察肺小动脉的超微结构,免疫组织化学染色法观察肺动脉平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR). Western-blotting检测肺动脉PDGFB/PDGFR-β mRNA及蛋白的表达。结果 1.C组、S1m、S2m及S3m组PaO2值分别为(96.2±4.3)、(92.1±5.2)、(90.5±4.1)及(89.6±4.8) mmHg,各组间比较,差异均无统计学意义(均P0.05)。 2.S3m组mRVSP及RVHI值为(65.63±5.6,54.79+7.13)与C组(14.07±4.18,32.41±0.26)比较,差异有统计学意义(P0.01)；S1m组(16.85±1.26,36.62±1.321、S2m组(23.57±4.51,40.23±2.12)与C组比较,差异均无统计学意义(均P0.05)。 3.C组、S1m、S2m及S3m组WA%值分别为(31.29±1.95)%、(42.68±2.24)%、(51.844±2.38)%、(62.11±1.39)%,随烟雾暴露时间延长,WA%呈时间依赖性增加,与C组比较,差异均有统计学意义(均P0.01)；烟雾暴露各组间比较,差异均有统计学意义(均P0.01)。 4.C组、S1m、S2m及S3m组肺动脉管壁胶原厚度分别为(4.67±0.36)μm、(8.96±1.80)μm、(11.8±2.12)μm、(15.3±1.65)μm。随烟雾暴露时间延长,肺动脉管壁胶原沉积呈时间依赖性增加,与C组比较,差异均有统计学意义(均P0.01)；烟雾暴露各组间比较,差异均有统计学意义(均P0.01)。 5.肺小动脉超微结构观察：C组内皮细胞形态正常,胞外未见胶原纤维增生,平滑肌细胞未见增生。S1m组肺小动脉内皮细胞形状不规则,内膜增厚,细胞内可见线粒体肿胀,平滑肌细胞轻度增生。S2m组内弹力膜厚薄不均,平滑肌走向不规则,胶原纤维增生。S3m组肺小动脉结构层次紊乱,内皮细胞变形严重,胶原纤维大量增生。 6.C组、S1m、S2m及S3m组肺动脉α-SMA表达量分别为(37.5±7.5)、(52.6±14.3)、(72.2±13.6)、(98.1±15.6),随烟雾暴露时间延长,肺动脉α-SMA表达量呈时间依赖性增加,与C组比较,差异均有统计学意义(均P0.01)；烟雾暴露各组间比较,差异均有统计学意义(均P0.01)。 7.肺动脉PDGFB/PDGFR-β mRNA和蛋白表达的比较 (1)C组、S1m、S2m及S3m组肺动脉PDGFB mRNA表达量分别为(0.31±0.09)、(0.35±0.02)、(0.42±0.01)、(0.55±0.03),随烟雾暴露时间延长,肺动脉PDGFB mRNA表达量逐渐增加。烟雾暴露各组与C组比较,差异均有统计学意义(均P0.01)。 (2)C组、S1m、S2m及S3m组肺动脉PDGFB蛋白表达量分别为(1.38+0.04)、(1.50±0.02)、(1.58±0.06)、(1.44±0.02)；随烟雾暴露时间延长,PDGFB蛋白表达量增加。烟雾暴露各组与C组比较,差异均有统计学意义(均P0.01)。 (3)C组、S1m、S2m及S3m组肺动脉PDGFR-β mRNA表达量分别为(0.21±0.09)、(0.41±0.02)、(0.61±0.03)、(0.83±0.08)；随烟雾暴露时间延长,PDGFR-β mRNA表达量逐渐增加。烟雾暴露各组与C组比较,差异均有统计学意义(均P0.01)。 (4)C组、S1m、S2m及S3m组肺动脉PDGFR-β蛋白表达量分别为(1.23±0.01)、(1.50+0.01)、(1.38±0.02)、(1.57±0.04)；随烟雾暴露时间延长,PDGFR-β蛋白表达量增加。烟雾暴露各组与C组比较,差异均有统计学意义(均P0.01)。 8.相关性分析mRVSP与RVHI成正相关(r=0.713,P0.05)；PDGFB mRNA及蛋白表达量与WA%均呈止相关(分别为r=0.941,r=0.605,均P0.05)；PDGFR-β mRNA及蛋白表达量与WA%均呈正相关(分别为r=0.936,r=0.820,均P0.05)；PDGFB与PDGFR-β mRNA表达量呈正相关(r=0.921,P0.05)；PDGFB与PDGFR-β蛋白表达无相关性(r=0.379,P0.05)。结论 1.烟雾暴露可使肺血管形态发生明显改变,肺小动脉超微结构异常,导致肺血管重塑,肺血流阻力增加,右心室收缩压升高。 2.烟雾暴露上调大鼠肺动脉PDGFB/PDGFR-β表达,PDGFB/PDGFR-β在肺血管重塑、肺动脉高压形成过程中起重要作用。第二部分血小板源性生长因子在香烟烟雾提取物介导的肺动脉平滑肌细胞增殖中的表达变化目的探讨香烟烟雾提取物(CSE)对大鼠肺动脉平滑肌细胞(rPASMCs)增殖的影响及血小板源性生长因子(PDGFB/PDGFR-β)在其中的作用。方法 1.培养rPASMCs,不同浓度CSE(0,2.5%,5%,10%,20%)作用于rPASMCs24小时,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测rPASMCs增殖,流式细胞术观察细胞周期变化。 2.不同浓度CSE(0,2.5%,5%,10%,20%)作用于rPASMCs24小时,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blotting分别检测PDGFB/PDGFR-β mRNA和蛋白表达。 3. rPASMCs与不同浓度PDGFR阻断剂伊马替尼(Imatinib)(1μM/L,2μM/L,4μM/L,8μM/L)预孵育1小时,然后暴露于10%CSE24小时,MTT法观察细胞增殖的变化。 4. rPASMCs与PDGFR阻断剂伊马替尼(Imatinib)8μM预孵育1小时,然后暴露于10%CSE24小时,Western-blotting检测PDGFB/PDGFR-β蛋白表达。结果 1.CSE各组(2.5%,5%,10%,20%)rPASMCs MTT吸光度(A)值分别为(1.839±0.128)、(2.241±0.182)、(2.951±0.072)、(4.329±0.176),与对照组(0.977±0.156)比较明显升高,差异均有统计学意义(均P0.01)。CSE各组(2.5%,5%,10%,20%)rPASMCs S期细胞百分数分别为(17.08±0.31)、(18.47±0.21)、(23.19±0.16)、(23.71±0.29),与对照组(13.04±2.39)比较明显升高,差异均有统计学意义(均P0.01)。CSE各组(2.5%,5%,10%,20%)rPASMCsG2期细胞百分数分别为(45.21±5.20)、(47.05±14.14)、(42.05±8.97)、(41.15±6.80),与对照组(22.77±3.04)比较明显升高,差异均有统计学意义(均P0.01)。 2.CSE各组(2.5%,5%,10%,20%)PDGFB mRNA表达量分别为(0.647±0.035)、(0.819±0.065)、(0.776±0.046)、(0.623±0.048),与对照组(0.411±0.026)比较,差异均有统计学意义(均P0.05)；CSE各组PDGFR-β mRNA表达量分别为(0.393±0.021)、(0.739±0.034)、(0.745±0.032)、(0.620±0.019),与对照组(0.411±0.011)比较,差异均有统计学意义(均P0.05)；CSE各组(2.5%,5%,10%,20%)PDGFB蛋白表达量分别为(0.367±0.015)、(0.716±0.033)、(0.897±0.041)、(1.202±0.039),与对照组(0.544±0.025)比较,差异均有统计学意义(均P0.05)；PDGFR-β蛋白表达量分别为(0.718±0.019)、(0.920±0.039)、(0.998±0.081)、(1.061±0.057),与对照组(0.585±0.026)比较,差异均有统计学意义(均P0.05)。 3.10%CSE组MTT(A)值(2.643±0.099)增高,与对照组(0.856±0.017)比较,差异有统计学意义(P0.05)；10%CSE+Imatinib各组(1μtM/L,21μM/L,41μM/L,8μM/L)(A)值均降低,分别为(2.012±0.391)、(1.997±0.379)、(1.458±0.495)、(1.022±0.102),与10%CSE组比较,差异均有统计学意义(P0.01)。 4.10%CSE处理后,rPASMCs中PDGFB蛋白表达量升高(1.662±0.271),与对照组(0.996±0.181)比较,差异有统计学意义(P0.05)；伊马替尼(Imatinib)十预后PDGFB蛋白表达量降低(1.231±0.192),与10%CSE组比较,差异有统计学意义(P0.05)；10%CSE处理后,rPASMCs中PDGFR-β蛋白表达量升高(1.581±0.153),与对照组(0.986±0.131)比较,差异有统计学意义(P0.05)；伊马替尼(Imatinib)干预后PDGFR-β蛋白表达量降低(1.211±0.192),与10%CSE组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论 1.CSE可诱导rPASMCs增殖。 2.CSE可使rPASMCs周期发生变化,细胞由G1期向S期和G2期转换,促进细胞DNA复制和有丝分裂。 3.CSE诱导PDGFB/PDGFR-p mRNA和蛋白表达上调。 4.CSE诱导PDGFB及PDGFR-β表达上调,二者存在相关关系。可能与PDGF信号通路配体PDGFB与受体PDGFR-β相互作用有关。 5. PDGFR阻断剂可抑制CSE诱导的rPASMCs增殖效应且对PDGFB/PDGFR-β表达上调有明显的抑制效应,其机制有待进一步研究。第三部分蛋白激酶C-δ途径促进大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的机制研究目的探讨蛋白激酶C-δ(PKC-δ)在香烟烟雾提取物(CSE)对大鼠肺动脉平滑肌细胞(rPASMCs)增殖中的影响及其对PDGFB/PDGFR-β表达的作用。方法 1.培养rPASMCs细胞,rPASMCs与不同浓度的PKC-δ阻断剂Rottlerin(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)预孵育1小时,然后暴露于10%CSE24小时,MTT法观察细胞增殖的变化。 2. rPASMCs与Rottlerin8nM/L预孵育1小时,然后暴露于10%CSE24小时,流式细胞术观察细胞周期的变化。 3. rPASMCs与不同浓度的PKC-δ阻断剂Rottlerin (1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)预孵育1小时,然后暴露于10%CSE24小时,采用RT-PCR、Western-blotting方法分别检测PKC-δ mRNA和蛋白及pi-PKC-δ蛋白的表达。 4. rPASMCs与不同浓度的PKC-δ阻断剂Rottlerin(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)预孵育1小时,然后暴露于10%CSE24小时,采用RT-PCR、Western-blotting方法分别检测PDGFB/PDGFR-p mRNA和蛋白的表达。结果 1.10%CSE组rPASMCs的MTT(A)值(3.535+0.353)增高,与对照组(0.873±0.184)比较,差异有统计学意义(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各组(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)A值均降低,分别为(2.322±0.358)、(2.227±0.291)、(1.903±0.212)、(0.944±0.109),与10%CSE组比较,差异均有统计学意义(均P0.01)。 2.10%CSE组rPASMCs的S期细胞百分数(22.39±1.09)增高,与对照组(6.51±1.23)比较,差异有统计学意义(P0.01)。10%CSE+Rottlerin8nM/L组S期细胞百分数降低为(12.21±1.96),与10%CSE组比较,差异有统计学意义(P0.01)。10%CSE组rPASMCs的G2期细胞百分数(17.12±0.45)增高,与对照组(4.03±2.96)比较,差异有统计学意义(P0.01)。10%CSE+Rottlerin8nM/L组G2期细胞百分数降低为(8.59±2.05),与10%CSE组比较,差异有统计学意义(P0.01)。 3.各组PKC-δ mRNA和蛋白表达变化 (1)各组PKC-δ mRNA和蛋白表达量：对照组为(0.955±0.049,0.758±0.131),10%CSE组为(1.068+0.079,0.873±0.011),10%CSE+Rottlerin各组(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)分别为(1.027±0.113,0.813±0.174)、(0.971±0.118,0.723+0.117)、(0.851±0.065,0.904±0.011)、(0.887±0.053,0.881±0.025),各组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。 (2)各组pi-PKC-δ蛋白表达量：10%CSE组(1.485±0.058)增高,与对照组(0.985±0.009)比较,差异有统计学意义(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各组(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)pi-PKC-δ蛋白表达量下降,分别为(1.257±0.050)、(1.146±0.174)、(1.051±0.019)、(1.006±0.018),与10%CSE组比较,差异均有统计学意义(均P0.05)。 4. Rottlerin阻断后各组PDGFB/PDGFR-β表达 (1)各组PDGFB mRNA表达：10%CSE组(1.245±0.020)增高,与对照组(0.649±0.046)比较,差异有统计学意义(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各组(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFB mRNA表达降低,分别为(1.235±0.086)、(0.722±0.035)、(0.679±0.023)、(0.676±0.035),与10%CSE组比较,差异均有统计学意义(均P0.05)。 (2)各组PDGFB蛋白表达：10%CSE组(1.746±0.132)增高,与对照组(0.654±0.009)比较,差异有统计学意义(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各组(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFB蛋白表达降低,分别为(1.322±0.066)、(0.913±0.020)、(0.932±0.219)、(0.918+0.013),与10%CSE组比较,差异均有统计学意义(均P0.05)。 (3)各组PDGFR-β mRNA表达：10%CSE组(1.728±0.029)增高,与对照组(0.973±0.069)比较,差异有统计学意义(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各组(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFR-β mRNA表达降低,分别为(1.225±0.056)、(1.021±0.074)、(0.935±0.051)、(0.745±0.074),与10%CSE组比较,差异均有统计学意义(均P0.05)。 (4)各组PDGFR-β蛋白表达：10%CSE组(1.207±0.058)增高,与对照组(0.657±0.009)比较,差异有统计学意义(P0.05)。10%CSE+Rottlerin各组,(1nM/L,2nM/L,4nM/L,8nM/L)PDGFR-β蛋白表达降低,分别为(1.176±0.050)、(0.848±0.174)、(0.843±0.019)、(0.838±0.018),与10%CSE组比较,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论 1.CSE对PKC-δ的mRNA和蛋白表达无明显作用。 2.CSE上调磷酸化PKC-δ蛋白表达,PKC-δ阻断剂Rottlerin对磷酸化PKC-δ蛋白表达上调有明显的抑制作用。 3.PKC-δ阻断剂Rottlerin可以抑制CSE诱导的rPASMCs细胞增殖效应。 4.PKC-δ阻断剂Rottlerin可以抑制CSE诱导的rPASMCs细胞周期变化。 5.PKC-δ阻断剂Rottlerin对CSE诱导的PDGFB和PDGFR-β表达上调有明显的抑制作用,CSE通过激活PKC-δ途径促进rPASMCs细胞PDGFB/PDGFR-β的表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】