靶向人NHE-1基因RNAi腺病毒构建及其对SH-SY5Y细胞内pH值的影响

发布时间：2018-01-22 17:44

  本文关键词： 钠氢交换蛋白-1 重组腺病毒 人神经母细胞瘤细胞 细胞内pH值　出处：《辽宁医学院》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的 构建靶向人NHE-1基因RNAi腺病毒表达载体,确定其感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值及其对SH-SY5Y细胞内pH值的影响。 方法 首先利用PCR检测目的基因人NHE-1在HEK-293细胞中的表达量,确定HEK-293细胞为干扰载体转染模型细胞;针对目的基因NHE-1及内参基因ACTB(Beta Actin)设计、合成荧光定量PCR引物三对,并对各基因以及各个引物进行PCR扩增条件优化,再依次通过退火、连接,构建含NHE-1前体miRNA的重组干扰质粒pcDNATM 6.2-GW/NHE-miR和阴性对照质粒pcDNATM 6.2-GW/ neg-miR,并转染HEK-293细胞,经RT-PCR的方法评价干扰效应,筛选出干扰效应最佳的靶序列;将干扰效应最佳片段使用BP重组系统重组到载体pDONR22 1,再使用LR重组系统将目的序列重组到腺病毒载体pAD/CMV/V5-DEST上,经测序获得腺病毒干扰质粒pAd-miR-NHE1,以Pac I酶切线性化后用脂质体法转染包装含有腺病毒E1的HEK-293细胞,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,用免疫法快速检测腺病毒滴度;采用不同MOI值进行梯度试验,确定人NHE-1基因靶向RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值。按照最佳MOI值感染SH-SY5Y细胞,利用荧光指示剂BCECF-AM方法荧光分光光度计检测SH-SY5Y细胞内pH值变化,Western Blotting(WB)检测NHE-1蛋白表达。 结果 PCR检测目的基因人NHE-1在HEK-293细胞中的表达丰度较高,确定HEK-293细胞为干扰载体转染模型细胞;RT-PCR的方法评干扰效应最佳的靶序列为NHE1-4;对腺病毒载体骨架及干扰载体骨架进行PCR检测,结果显示腺病毒载体骨架扩增片段约300bp,干扰载体骨架扩增片段约200bp,与预期产物大小相符,提示最佳靶向人NHE-1 RNAi病毒表达载体构建成功;按照腺病毒感染性滴度快速测定试剂盒的方法对Ad-miR-NHE1腺病毒病毒液的滴度进行测定,得出Ad-miR-NHE1的滴度约4×109;采用不同MOI值进行梯度试验,确定人NHE-1靶向RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值为160;按照最佳MOI值将NHE1-miRNA腺病毒感染至SH-SY5Y细胞,荧光指示剂法检测细胞内pH值,RNAi腺病毒感染组细胞内pH值24h为5.969±0.030、48h为5.981±0.023、72h为5.975±0.024,负对照组细胞内pH值24h为6.050±0.043、48h为6.038±0.069、72h为6.026±0.050,空白对照组细胞内pH值24h为6.031±0.061、48h为6.048±0.042、72h为6.031±0.042,24hRNAi腺病毒感染组细胞内pH值较空白对照组和负对照组降低,P值分别为0.015及0.002,差别有显著性意义(P0.05),空白对照组和负对照组细胞内pH值无明显变化,P值为0.399,差异无显著性意义(P0.05),48hRNAi腺病毒感染组细胞内pH值较空白对照组和负对照组降低,P值分别为0.012及0.030,差别有显著性意义(P0.05),空白对照组和负对照组细胞内pH值无明显变化,P值为0.683,差异无显著性意义(P0.05),72hRNAi腺病毒感染组细胞内pH值较空白对照组和负对照组降低,P值分别为0.010及0.018,差别有显著性意义(P0.05),空白对照组和负对照组细胞内pH值无明显变化,P值为0.805,差异无显著性意义(P0.05),感染RNAi腺病毒后24h较48h和72h组细胞内pH值变化无明显差别,P值分别为0.703和0.723,差异无显著性意义(P0.05),48h较72h组细胞内pH值无明显变化,P值为0.463,差异无显著性意义(P0.05);感染RNAi腺病毒后24h收集SH-SY5Y细胞总蛋白, WB检测RNAi腺病毒感染组NHE-1蛋白较空白对照组和负对照组表达下降,差别有显著性意义(P0.05),空白对照组和负对照组NHE-1蛋白差异无显著性意义(P0.05),证实成功沉默NHE-1基因表达,导致细胞内pH值下降。 结论 成功构建最佳靶向人NHE-1基因RNAi腺病毒表达载体,通过利用小干扰RNA技术抑制细胞表面NHE-1基因表达,建立了细胞内酸化模型,为探索细胞内的酸性变化与β淀粉样蛋白产生和降解相关酶类的改变提供了有效的工作基础。
[Abstract]:objective
The target human NHE-1 gene RNAi adenovirus expression vector was constructed to determine the optimal MOI value of SH-SY5Y cells and its effect on the pH value in SH-SY5Y cells.
Method
The expression of PCR gene NHE-1 in HEK-293 cells, HEK-293 cells were identified as cells transfected with interference vector model; according to the NHE-1 gene and reference gene ACTB (Beta Actin) design, synthesis of fluorescent quantitative PCR primers three pairs, and each gene and each primer for PCR amplification conditions, followed by annealing, connection, construct containing NHE-1 precursor miRNA recombinant plasmid pcDNATM 6.2-GW/NHE-miR and negative control plasmid pcDNATM 6.2-GW/ neg-miR was transfected into HEK-293 cells by RT-PCR method to evaluate the interference effect, select the best target sequence interference; interference effect will best use of recombinant fragment BP recombination system to vector pDONR22 1, and then to the sequence of recombinant adenovirus vector to pAD/CMV/V5-DEST using LR recombination system, obtained by sequencing adenovirus plasmid pAd-miR-NHE1 Pac was linearized with I After transfected into packaging containing adenovirus E1 HEK-293 cells, plaque purified virus and repeated freeze-thaw virus amplification, rapid detection of adenovirus titer by immune method; using different MOI values by gradient test, determine the human NHE-1 gene targeting RNAi adenovirus infected SH-SY5Y cells. The best MOI value according to the best MOI value the infection of SH-SY5Y cells, using the fluorescent indicator BCECF-AM fluorescence spectrophotometer to detect the SH-SY5Y intracellular pH changes, Western Blotting (WB) to detect the expression of NHE-1 protein.
Result
Objective to detect the PCR gene NHE-1 expression in HEK-293 cells was higher, the HEK-293 cells were identified as interference vector transfected cells RT-PCR model; evaluation method of target sequence interference effect best is NHE1-4; the detection of PCR adenovirus vector and vector skeleton. The results showed that the adenovirus skeleton fragment about 300bp interference vector backbone fragment is about 200bp, and the size of the expected product line, suggesting the best NHE-1 targeting human RNAi virus expression vector was successfully constructed; titer of adenovirus to Ad-miR-NHE1 solution method according to the kit for quick determination of the titer of adenovirus infection titer determination, that Ad-miR-NHE1 is about 4 * 109; with different MOI value gradient the test, determine the NHE-1 targeting adenovirus RNAi SH-SY5Y cells infected with the optimum MOI value is 160; in accordance with the best MOI value of the NHE1-miRNA adenovirus infection to SH-SY5Y cells. Cell detection light indicator method in pH value, RNAi adenovirus infection group intracellular pH 24h 5.969 + 0.030,48h 5.981 + 0.023,72h 5.975 + 0.024, negative group of intracellular pH 24h 6.050 + 0.043,48h 6.038 + 0.069,72h 6.026 + 0.050 in the control, the blank control group, intracellular pH 6.031 + 24h 0.061,48h 6.048 + 0.042,72h 6.031 + 0.042,24hRNAi adenovirus infection group intracellular pH decreased compared with the blank control group and negative control group, the P values were 0.015 and 0.002, the difference was significant (P0.05), blank control group and negative control group cells had no obvious change of pH value, P value is 0.399, no significant difference (P0.05), adenovirus 48hRNAi infection group, the intracellular pH decreased compared with the blank control group and negative control group, the P values were 0.012 and 0.030, the difference was significant (P0.05), blank control group and negative control group cells pH value had no obvious change, P value 0.6 83, no significant difference (P0.05), adenovirus 72hRNAi infection group, the intracellular pH decreased compared with the blank control group and negative control group, the P values were 0.010 and 0.018, the difference was significant (P0.05), blank control group and negative control group cells pH value had no obvious change, P value 0.805, no significant difference (P0.05), RNAi infection of adenovirus 24h is 48h and 72h group pH values had no significant difference, P values were 0.703 and 0.723, there was no significant difference (P0.05, 48h) compared with 72h group, the intracellular pH had no obvious change, P value 0.463, no significant difference (P0.05); infection of adenovirus RNAi 24h after collecting the total protein of SH-SY5Y cells, WB detection of RNAi adenovirus infection group NHE-1 protein compared with the blank control group and negative control group was decreased, the difference was significant (P0.05), blank control group and negative control group NHE-1 protein had no significant difference the meaning of (P0.05), It was confirmed that the successful silencing of the expression of NHE-1 gene resulted in the decrease of pH in the cells.
conclusion
The best expression vector targeting human NHE-1 gene RNAi adenovirus was successfully constructed, inhibition of cell surface expression of NHE-1 gene by using small interfering RNA technology, established a model for exploring the intracellular acidification, intracellular acid changes and amyloid formation and degradation enzymes change provides the basis for effective work.

【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R346

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本文编号：1455330