报告基因标记的HCV长期表达小鼠模型的优化及在疫苗评价中的应用
本文关键词： 丙型病毒性肝炎 水动力转染 优化的噬菌体整合酶 DNA疫苗 出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2011年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：丙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的常见病和多发病。丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染是造成慢性肝炎,肝硬化及肝癌的主要原因之一。长期以来,由于缺少有效的小动物模型,严重阻碍了HCV防治工作的进展,迄今尚无有效的治疗手段及预防性疫苗。因此建立具有实际应用价值的小动物模型,仍然是当今丙型肝炎防治研究的重大课题。 本研究室在前期工作中,基于成年小鼠,联合应用水动力转染技术与噬菌体整合酶,初步建立了报告基因萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)标记的HCV全基因组小鼠体内表达模型,但小鼠体内HCV的表达水平、表达时间有待于进一步提高,模型的重复性、稳定性尚未评价。针对这一问题,本课题引进密码子优化的噬菌体整合酶,对目的基因在小鼠肝脏长期高效稳定表达的技术平台进行了优化,提高了外源基因在小鼠肝细胞中的整合效率。通过优化的技术平台,实现Fluc标记的HCV全基因组表达载体在成年小鼠肝脏染色体上的高效整合,延长了HCV在小鼠体内的表达时间、提高了表达量,并对模型的重复性、稳定性进行了评价,建立了HCV功能基因表达小鼠模型。该模型以Fluc作为HCV全基因组表达的内参,HCV功能基因的表达水平通过活体荧光成像对Fluc进行监测而得以反应。迄今为止,HCV全基因组已经在小鼠体内长期表达6个月以上。在此基础上,构建HCV NS3/4A DNA疫苗,以此模型为基础进行HCV NS3/4A DNA疫苗的评价,为疫苗开发提供实验基础。具体研究内容及结果如下: 1.目的基因在小鼠肝脏长期高效稳定表达的技术平台的优化 通过水动力转染法将带有噬菌体整合酶识别位点attB的Fluc表达载体pCI-attB-AATP -Fluc(pAA-Fluc)分别和噬菌体φC31整合酶表达载体(pCMV-int)以及密码子优化的噬菌体φC31整合酶表达载体(Pphic31φ)共转染至Balb/c小鼠体内,活体荧光成像技术连续监测Fluc的表达并对两组Fluc活性进行比较,发现共转染Pphic31φ组小鼠Fluc活性明显提高,表达时间更长,实现了对目的基因在小鼠肝脏长期高效稳定表达的技术平台的优化。 2.Fluc标记的HCV全基因组小鼠体内长期表达模型的优化 以上述技术平台为基础,通过水动力转染法将Fluc标记的HCV全基因组表达载体pCI-attB-AATP-Fluc-EMCV IRES-HCV(pAA-Fluc-IRES-HCV)及对照载体pAA-Fluc分别与Pphic31φ共转染至Balb/c小鼠体内。实验证实,在Pphic31φ作用下,HCV全基因组表达框架整合到小鼠肝脏第2号染色体的mpsL1位点,在小鼠肝脏获得稳定表达,长达180d。经反复实验证实,模型的稳定性好,重复性强。 3.Fluc标记的HCV全基因组小鼠体内长期表达模型在疫苗评价中的应用 为了验证模型在疫苗评价中的应用,我们构建了HCV NS3/4A DNA疫苗,以此模型为基础进行HCV NS3/4A DNA疫苗体内作用效果的评价。为此比较了下肢静脉水动力转染技术、电转染法两种免疫方式的转染效率,将pGL3-CMV分别通过下肢静脉水动力转染技术、电转染法转染肌肉组织,在不同时间点监测Fluc活性,发现下肢静脉水动力转染技术转染的肌肉组织Fluc的表达量更高,表达时间更长。因此本实验选择下肢静脉水动力转染技术作为免疫方式,以NS3/4A表达载体pVAX-NS3/4A为DNA疫苗免疫Balb/c小鼠,以pVAX作为对照,免疫两次后,水动力转染pAA-Fluc-IRES-HCV和Pphic31φ质粒,观察Fluc活性的变化。NS3/4A DNA疫苗免疫组,在建模后第5d开始监测到Fluc的下降,第9d出现明显统计学差异。上述结果初步表明NS3/4A疫苗促进了小鼠免疫系统对表达HCV的肝细胞的清除,推测可能是NS3/4A疫苗所激发的CTL反应对肝细胞的杀伤造成的,提示本模型可以用于疫苗评价。 综上所述,运用密码子优化的噬菌体整合酶,优化了目的基因在小鼠肝脏长期高效稳定表达的技术平台,提高了Fluc标记的HCV全基因组在小鼠体内的表达水平,并对模型的重复性、稳定性进行了评价,建立了HCV全基因组长期表达小鼠模型。利用该模型对HCV疫苗进行初步评价,通过报告基因Fluc活性的高低反映HCV疫苗是否发生保护性作用,为HCV疫苗研究提供实验基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392.1
【共引文献】
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，本文编号：1470273
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