Snapin通过阻碍Cav1.3钙离子通道的内质网转出而调节其膜转运过程

发布时间：2018-02-09 14:05

本文关键词： 心房肌 Cav1.3 Snapin 膜转运　出处：《南京师范大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：心肌细胞膜上存在着两种不同电流特性的的钙通道：L型和T型。与T型钙通道相比,L型钙通道具有大电导、高电压激活、长时间开放,能和多种拮抗剂作用的特点。就功能而言,L型钙通道电流(ICa-L)不仅参与心肌动作电位平台期的形成和维持,而且在心肌兴奋-收缩偶联中起着极为重要的作用。已知,在哺乳类组织,编码L型Ca2+通道a1亚基的基因有4种,分别是Cavl.1、 Cavl.2、Cav1.3、Cav1.4.最初人们认为心脏中的LVCC仅包括Cav1.2,但后来发现Cav1.3在心脏中也有表达,并且优势表达于窦房结、房室结和心房,Cavl3基因敲除小鼠表现出窦性心动过缓和房室传导阻滞,所有这些都表明其在维持正常的心脏节律中发挥着至关重要的作用。但是,关于Cav1.3钙离子通道调节机制目前所知甚少。本实验室用Cavl.3位于胞内的C末端为诱饵,利用酵母双杂交方法从人心脏cDNA文库中筛选出了一种新型相互作用蛋白Snapin,一种广谱表达、在SNARE介导的膜融合过程起辅助作用的小分子蛋白。在本研究中,利用过表达Cav1.3与Snapin的HEK293细胞及小鼠的心房组织进行免疫共沉淀实验结果表明,二者的相互作用不仅存在于体外异源表达系统,而且也存在于心房肌细胞；免疫细胞化学实验证实,二者无论在过表达Cavl.3与Snapin的HEK293细胞还是小鼠心房肌细胞膜上都存在着共分布。通过设计多个Snapin的片段与Cav1.3的C末端进行GST pull down实验,确定了Snapin C末端的coil-coil domain是负责与Cavl.3结合的区域。利用全细胞膜片钳技术在过表达Cavl.3与Snapin的HEK293细胞记录钙离子电流(ICa-L)的结果表明,Snapin显著地抑制ICα-L密度。进一步经过一系列的生物化学分析发现,过表达Snapin不仅使定位于细胞膜上的Cav1.3钙通道数目减少,而且使Cav1.3蛋白总体表达量下降；这一结果在免疫荧光染色检测中得到进一步印证：在过表达Snapin的HEK293细胞,膜分布减少的Cav1.3均匀分布在胞质中,并与内质网共定位,但与单独表达Cavl.3钙通道的细胞相比,这种共定位信号明显减弱。此外,本研究发现,过表达Snapin对Cav1.3mRNA表达水平没有影响,但显著加速Cavl.3的泛素化降解过程,蛋白酶体抑制剂MG132处理可以显著逆转其降解,说明Snapin不影响Cavl.3通道蛋白的合成,而加速其通过蛋白酶体的降解。有趣的是,本研究还发现,Snapin和Cav1.3还与另外一种SNARE成员SNAP-23形成三维复合物,这种蛋白是一种广泛表达的SNAP-25的同源物。结果显示随着Snapin表达量的增加,SNAP-23与Cav1.3结合的量逐渐减少,提示Cavl.3钙通道的内质网转出受到Snapin与SNAP-23亲和能力的双重调控。综上所述,本研究首次证明Snapin竞争性地干扰SNAP-23结合Cav1.3的C末端,由此导致Cav1.3的内质网滞留以及随后的通过蛋白酶体的泛素化降解,而这正是过表达Snapin引起Cav1.3蛋白表达总量和膜表达量下降的直接原因。Snapin如何与SNAP-23协调作用实现其对Cav1.3钙离子通道生物学功能的调节有待进一步深入研究。
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【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329.2;Q78

【参考文献】