RNA干扰沉默TGFβRⅠ基因对人胚肺成纤维细胞影响的实验研究

发布时间：2018-02-09 15:06

  本文关键词： 急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征 肺纤维化 RNA 干扰 转化生长因子 β1 βⅠ型受体　出处：《重庆医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：构建针对转化生长因子βⅠ型受体（TGFβRⅠ）的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体，通过感染人胚肺成纤维细胞株MRC-5，，观察TGFβRⅠ表达受抑制后，转化生长因子β1(TGF-β1)对MRC-5细胞的增殖、细胞周期、活化、胶原表达以及炎性因子（TNF-α）释放的影响。 方法：(1)根据人TGFβRⅠ基因编码序列设计4个小干扰序列和1个阴性对照序列，BLAST验证基因同源性。将设计的干扰序列合成相应的寡核苷酸DNA，退火形成双链后与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pMagic4.0/EGFP载体连接，PCR行阳性克隆筛选并予以测序鉴定，然后进行慢病毒包装。(2)将4对TGFβRⅠ-siRNA重组慢病毒载体和1对阴性对照慢病毒载体感染体外培养的MRC-5细胞，感染48h和72h后分别采用Real time PCR和Western blot检测TGFβRⅠmRNA和蛋白表达。(3)将干扰效率最高的TGFβRⅠ-siRNA慢病毒和阴性对照慢病毒感染MRC-5细胞48h，之后实验分为4个组：CON组（MRC-5予以DMEM正常培养），T组（MRC-5予以5ng/ml TGF-β1刺激），NC+T组（感染阴性对照慢病毒的MRC-5予以5ng/ml TGF-β1刺激）和RNAi+T组（感染TGFβRⅠ-siRNA慢病毒的MRC-5予以5ng/ml TGF-β1刺激）。采用MTT法观察各组细胞的增殖状态，流式细胞仪检测细胞周期时相分布，天狼猩红染色法测定细胞内总胶原含量，RT-PCR检测各组细胞α-SMA的mRNA表达情况，ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α表达水平。 结果：(1)经PCR鉴定以及测序结果证实，成功构建TGFβRⅠ基因特异性siRNA慢病毒载体。(2)倒置荧光显微镜显示各感染组细胞发出绿色荧光，当感染复数（MOI）为30、加入Polybrene5ng/ml时，MRC-5细胞感染病毒的效率达93%。Real-time PCR检测结果显示，TGFβRⅠ-siRNA1~4感染组TGFβRⅠmRNA表达水平较正常对照组分别下降了26.8%、80.8%、70.7%和79.7%（P0.05），其中以TGFβRⅠ-siRNA2的干扰效率最高。Western blot检测结果显示抑制TGFβRⅠ蛋白表达下降趋势与Real-time PCR结果一致。(3)MTT法和流式细胞仪检测显示，与其他各组比较，RNAi+T组细胞增殖受到显著抑制，RNAi可使细胞周期阻滞于G0/G1期，进入S期细胞比例减少（P0.05），而其他三组之间细胞的增殖能力和周期分布无统计学差异（P0.05）。(4)天狼猩红染色法检测显示，与CON组比较，T组和NC组则细胞内胶原表达明显增加(P0.05)；RNAi+T组与T组比较，细胞内总胶原表达明显降低(P0.05)。(5) RT-PCR检测显示，与CON组比较，T组和NC组细胞内α-SMAmRNA表达明显增加(P0.05)，而与T组比较，TGFβRⅠ基因RNAi能够显著抑制细胞内α-SMA mRNA表达(P0.05)。(6)ELISA检测显示T组细胞上清液中TNF-α含量高于CON组(P0.05)，RNAi+T组则可降低TGF-β1刺激后细胞TNF-α的浓度升高(P0.05)。 结论：(1)针对TGFβRⅠ基因特异性siRNA慢病毒载体能够显著抑制靶基因的表达；(2)抑制TGFβRⅠ基因表达后，MRC-5细胞增殖受抑制，细胞内DNA合成下降，其生长停滞于G0/G1期；(3)慢病毒介导的TGFβRⅠ基因RNAi能够抑制TGF-β1刺激引起的MRC-5细胞活化、胶原合成和炎性因子（TNF-α）释放。
[Abstract]:Aim: to construct the RNA interference RNAi lentivirus vector targeting transforming growth factor 尾 I receptor TGF- 尾 R 鈪

本文编号：1498208