IFNγ-STAT1信号通路对打破内毒素耐受作用机制的研究

发布时间：2018-02-19 21:51

本文关键词： STAT1 p65 IFNγ 内毒素耐受 RAW264.7　出处：《山东大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成成分,可以有效的激活巨噬细胞。内毒素耐受(endotoxin tolerance, ET)是指动物或体外培养的单核／巨噬细胞等在给予小剂量的LPS预处理后,对LPS再次刺激时无反应或反应性明显降低的现象。临床上,败血症患者单核巨噬细胞出现耐受状态会导致机体的免疫抑制甚至是死亡。通过对鼠的巨噬细胞及人的单核细胞的内毒素耐受研究发现,先用小剂量LPS预处理后,再用正常剂量LPS处理细胞,许多的炎性因子和趋化因子(如TNF α,IL-6,IL-12,IL-1b,CCL3,CCL4和CXCL10)出现低表达现象,然而,许多的抗炎性细胞因子(如IL-10,TGF-β,IL-1),C型凝集素受体(如MARCO, CLEC4a和CD64)及负向调节因子(如IRAK-M)等分子则出现高表达现象。除了单核巨噬细胞外,树突状细胞与中性粒细胞等其它骨髓来源的细胞也受到内毒素耐受的影响。发生内毒素耐受的树突状细胞的细胞因子如IL-6,IL-12和TNF α的表达受到抑制,但是IL-10的表达和细胞内吐作用则产生明显的增强。大量文献报道,内毒素耐受可以作为一种负反馈的免疫调节方式在许多生命活动中发挥重要作用；。；对内毒素耐受的调节是多水平方面的,包括：受体水平的调节,信号分子通路水平的调节,负向作用分子的调节,转录后调节及染色质重塑水平的调节,以及MicroRNA水平的调节。这些机制对于内毒素耐受的调节共同发挥着重要的作用。长期以来,对于内毒素耐受机制的研究,已经有很多报导,但是关于如何打破内毒素耐受形成及关于内毒素耐受消除机制的研究却鲜有报导。因此在完善内毒素耐受理论方面及治疗内毒素耐受引起的重大临床疾病方面,研究内毒素耐受消除的机制都有着重大意义。基于以上,本研究拟从以下几个方面进行：研究目的： 1、参照相关文献建立了IFN γ介导的打破内毒素耐受形成的模型,检测STAT1分子在IFN γ刺激中对炎性因子产生的影响； 2、研究STAT1分子在内毒素刺激及IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的现象中发挥什么样的作用； 3、探讨STAT1分子对IFNγ介导的打破内毒素耐受的形成中发挥作用的机制。研究方法： 1、建立IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的模型,并检测STAT1分子对炎性因子产生的影响。 1.1IFNγ介导的打破内毒素耐受的形成中炎性因子的检测参照相关文献建立了IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的模型。通过RT-PCR检测不同炎性因子的mRNA水平变化及通过ELISA方法检测培养上清中的炎性因子的表达水平变化。 1.2RT-PCR分析IFNγ刺激不同细胞后细胞因子的变化用RT-PCR的方法,检测分析IFNγ刺激巨噬细胞系RAW264.7及小鼠腹腔来源的原代巨噬细胞中炎性因子的表达变化情况。 1.3检测STAT1分子的小干扰RNA在IFNγ刺激细胞中的作用首先在HEK293细胞及RAW264.7细胞系中用RT-PCR及Western Blot Blot方法验证小干扰RNA的效率,然后将验证好的小干扰RNA转染细胞系并且用IFNγ刺激,检测炎性因子表达的变化情况。 2、研究STAT1蛋白分子在打破内毒素耐受作用中与转录因子的相互作用。 2.1用IFNγ刺激巨噬细胞系RAW264.7后,检测STAT1分子与转录因子的结合我们用IFN γ(浓度为lOng/ml)刺激细胞系RAW264.7,分为对照组和刺激组,分别用P50、P65、P300的一抗做免疫共沉淀,然后进行Western Blot Blot实验,用STAT1作为一抗,检测STAT1分子在受到IFNγ刺激后,与不同转录因子的结合变化情况。 2.2研究在IFNγ介导的打破内毒素耐受的过程中,STAT1分子与转录因子的结合情况参照相关文献建立IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的模型,对照组、耐受组和IFNγ预刺激组为一个研究组,分别用P50、P65、P300的一抗做免疫沉淀,然后然后进行Western Blot Blot实验,用STAT1作为一抗,从而检测STAT1分子与不同转录因子在耐受消除现象中的结合变化情况。 2.3转染STAT1过表达载体和Myd88过表达载体以及NF-KB报告基因载体后,检测NF-KB报告基因的活性变化为了进一步证明我们关于STAT1结合P65之后起到的抑制NF-KB活性的猜想,我们设计了双荧光报告基因实验。在HEK293细胞中转染了STAT1的表达质粒和接头分子Myd88后,通过双荧光报告基因的方法,检测STATl分子对NF-к B报告质粒活性的影响。 3、在IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的模型中,分离质核蛋白检测相关分子入核的变化。基于以上实验结果,我们得出STAT1分子可以与转录因子P65相互结合,从而干扰P65的活化,使下游的炎性因子如IL-6表达受到抑制,关于STAT1分子结合了P65之后是如何发挥抑制作用的机制,我们通过阅读相关的文献认识到STAT1分子作为一种转录因子的同时,还具有一种特殊的功能,就是STAT1可以与其它的转录因子相互结合后,作为一种cytoplasmic attenuator,通过抑制其它的转录因子活性来间接的对下游分子进行调节。因此,我们设计了质核蛋白分析的试验。如下： 3.1在内毒素耐受中,分离提取细胞质核蛋白,检测P50变化建立IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的模型,用LPS进行不同时间点的刺激后,分离提取细胞的质核蛋白质,然后进行Western Blot Blot实验,用P50作为一抗,检测P50分子的蛋白表达及分布情况。 3.2在内毒素耐受中,分离提取细胞质核蛋白,检测P65变化建立IFN γ介导的打破内毒素耐受形成的模型,用LPS进行不同时间点的刺激后,分离提取细胞的质核蛋白质,然后进行Western Blot Blot实验,用P65作为一抗,检测P65分子的蛋白表达及分布情况。。研究结果： 1、成功建立了IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的模型,同时发现STAT1分子影响了炎性因子IL-6的表达。 1.1建立了IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的模型,明确了IL-6在模型中的表达变化情况用细胞系RAW264.7设计了三组实验,分别是对照组、耐受组和IFNγ预刺激组。先用低剂量的LPS刺激24h后,接着再用高剂量的LPS在不同时间点刺激,用RT-PCR方法检测IL-6的mRNA水平的变化以及通过ELISA方法检测了IL-6蛋白水平的变化,发现与耐受组相比,IFN γ预刺激组中,IL-6分子的表达水平出现明显的恢复与上调,说明在IFNγ预刺激后,对耐受产生了明显的消除作用,这都与已报道文献中一致。 1.2用IFNγ刺激不同细胞系后,检测到IL-6表达水平是明显上调的 IFNγ在不同时间点刺激细胞系RAW264.7及小鼠腹腔来源的原代细胞,提取细胞RNA通过RT-PCR方法检测,发现IL-6的mRNA水平随着IFNγ刺激时间的增长出现明显的上调。 1.3STAT1分子被干扰掉之后,再用IFNγ刺激细胞,检测到IL-6表达水平出现下调在HEK293细胞及RAW264.7细胞系中用RT-PCR及Western Blot方法验证STAT1分子的小干扰RNA的效率,然后将干扰效率高的小干扰RNA转染到RAW264.7细胞系中,再用IFNγ刺激不同时间点,用RT-PCR检测到IL-6的mRNA水平与对照组相比,出现明显下调的情况。这证明STAT1分子在炎性因子IL-6的表达中起到重要的调节作用。 2、通过免疫共沉淀方法,确定了STAT1分子与P65、P50、P300的结合。 2.1IFNγ刺激RAW264.7细胞系后,检测到STAT1与P65、P50的结合增强用IFNγ刺激RAW264.7细胞系,分为对照组和刺激组,提取细胞蛋白质,做蛋白质免疫共沉淀,Western Blot检测到STAT1与P65,P50的结合在刺激组中比对照组中有明显增强。 2.2在IFNγ介导的打破内毒素耐受的形成中,STAT1分子与P65、P50的结合在各组中不同建立IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的模型,分为对照组、耐受组和IFNγ预刺激组,LPS刺激不同时间点后,提取蛋白质,做蛋白质免疫共沉淀,WesternBlot检测三组中STAT1与P65、P50的结合变化,发现IFN γ预刺激组与耐受组相比,STAT1分子与P65结合减弱,STAT1分子与P50结合增强。 2.3STAT1分子抑制NF-κB报告基因的活性 STAT1的过表达载体与接头分子Myd88的过表达载体以及NF-к B报告基因载体共转然HEK293细胞后,发现与对照组相比,共转染了STAT1过表达载体组可显著降低MyD88所诱导的NF-к B报告基因的荧光素酶活性。 3、细胞质核蛋白质检测,发现P65、P50的蛋白水平在质核中表达分布不同。 3.1分离提取细胞质核蛋白质,检测P50蛋白水平变化建立IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的模型,分离提取细胞的质核蛋白质,利用Western Blot方法,发现IFN γ预刺激组与耐受组相比,P50在细胞质和细胞核中分布变化不明显。由此,我们推测P50转录因子在IFN γ介导的内毒素耐受的抑制现象中可能是不起作用的。 3.2分离提取细胞质核蛋白质,检测P65蛋白水平变化建立IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的模型,分离提取细胞的质核蛋白质,利用Western Blot方法,发现IFNγ预刺激组与耐受组相比,在细胞质中,P65蛋白表达明显变弱,而在细胞核中,P65蛋白水平是出现一定的增强。结论： 1、IFNγ预刺激后会打破内毒素耐受的形成,STAT1分子促进IL-6的表达； 2、STAT1分子能够与P65、P50结合,STAT1分子对NF-к B报告基因的活化起抑制作用； 3、细胞质核蛋白质分析,IFN γ预刺激组与耐受组相比,,在细胞质中,前者的P65蛋白表达明显变弱,而在细胞核中,前者P65蛋白水平是出现一定的增强。由此,我们得到IFNγ介导的打破内毒素耐受形成的过程中,STAT1分子的一种特殊分子作用机制,就是STATl分子可以在细胞质中与其他蛋白转录因子如P65相互结合,影响其功能活化及入核情况,从而对下游的炎性因子的表达产生影响,这种作用机制的阐明,我们还要进一步的去研究与发现,同时,在STAT1分子E3连接酶活性研究基础上,我们积极探讨在IFNγ介导的打破内毒素耐受的形成中STAT1分子对P65转录因子的一种泛素化作用,我们考虑到在这种现象中,STAT1分子所起的作用很可能是两种机制共同作用的结果。创新点及意义： 1、本研究揭示了IFNγ介导的打破内毒素耐受的形成中一种新的分子机制。首次证实了STAT1分子对于IFNγ介导的打破内毒素耐受的形成中的调节作用,而且阐明了这种作用的机制是转录因子STAT1分子与转录因子P65结合,使蛋白分子P65滞留在细胞质中,P65不能得到有效的活化并入核发挥其转录活性,从而使炎性因子的表达出现下调的情况。但是在IFN γ预刺激后,STAT1磷酸化活化,与P65的结合抑制作用减弱甚至消失,并且能够促进P65活化入核,发挥转录活性,促进下游炎性因子如IL-6的表达,从而消除内毒素耐受的产生,同时,对于STAT1分子作用机制的研究目前来说还不是很明确,还需要本课题组相关人员进一步的研究和探讨去揭示具体的作用机制。 2、本研究揭示了STAT1分子在IFNγ介导的打破内毒素耐受的形成中的重要作用机制。虽然耐受现象的产生是对机体的一种保护机制,可以防止过强的炎症反应的发生,但是它同时也是一种免疫抑制现象,这会导致机体免疫反应的延滞,临床上这对于败血症患者来说是诱使死亡的一个重要原因。我们的研究就为败血症或是其它免疫耐受现象的疾病的治疗和预防提供了可能。同时,对于内毒素耐受及如何打破内毒素耐受的形成的研究,还需要我们进一步的深入探讨。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

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