脂筏对丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒和肠道病毒71型细胞入侵的影响及其机制研究

发布时间：2018-02-23 20:03

本文关键词： 脂筏细胞入侵丙型肝炎病毒日本脑炎病毒肠道病毒71型　出处：《第二军医大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：细胞膜中有一类特殊的脂质结构，富含胆固醇和磷鞘脂，在细胞膜上呈岛状分布，如漂浮在甘油磷脂海洋上的木筏，因此被称为“脂筏”（lipid raft）。脂筏是细胞进行多种生命活动的活跃区域，通过为蛋白质的相互作用提供募集平台，在跨膜信号转导、跨膜运输分选、细胞骨架重建等过程中都发挥重要的作用。作为病毒感染的首要环节，入侵在病毒整个生活周期中具有举足轻重的作用，也是抗病毒研究策略的重要靶标。病毒入侵宿主细胞必须经过以下几个步骤：（1）吸附到宿主细胞表面，（2）穿入细胞质或内含体，（3）脱壳。病毒为了完成从胞外到胞内的穿膜过程，往往利用宿主细胞膜上的某些结构域或微环境。目前研究证实，作为细胞膜的重要组成部分，脂筏是病毒与宿主细胞相互作用的活跃区域。脂筏调节包膜病毒细胞入侵的机制大致有四种：（1）病毒包膜蛋白锚固于脂筏中；（2）病毒受体为脂筏定位；（3）基于脂筏的病毒包膜蛋白构象变化或膜融合；（4）脂筏依赖的病毒内吞。人免疫缺陷病毒（HIV）是一个研究得较清楚、被归为脂筏病毒的包膜病毒：HIV包膜蛋白gpl20与脂筏中的胆固醇结合，其受体CD4及辅助受体CCR5均为脂筏蛋白；一些靶向脂筏的化合物也显现出很强的抗HIV活性，提示了以脂筏作为抗病毒药物靶点的可能性。然而，不同的包膜病毒识别不同的受体，膜融合触发机制又有pH依赖和非依赖之分，因此包膜病毒利用脂筏完成有效入侵的方式也各不相同。了解脂筏在病毒细胞入侵中的作用环节，可针对性地设计和研发抗病毒药物。相对于包膜病毒膜融合触发机制的深入研究，非包膜病毒的细胞入侵机制知之甚少。目前研究发现，有些非包膜病毒通过脂筏介导的内吞方式进入靶细胞，比如肠道病毒1型（Echovirus1，EV1）、猿猴病毒40（Simian Virus40，SV40）等；有些则通过与定位在脂筏上的受体结合而启动病毒入侵，如：柯萨奇病毒（Coxsackieviruses）、轮状病毒（Rotavirus）等。因此，探索脂筏调控病毒感染的膜上事件，有利于进一步阐明病毒细胞入侵的分子机制。细胞膜是阻断病毒感染靶细胞的第一道屏障。本课题从细胞膜脂筏入手，以三种单正链RNA病毒为研究对象，包括有包膜的丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒以及无包膜的肠道病毒71型，研究脂筏调节病毒与宿主细胞相互作用的分子机制，探讨不同病毒利用脂筏完成细胞入侵的区别与联系。一、脂筏影响丙型肝炎病毒细胞入侵的机制研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)属于黄病毒科、丙型肝炎病毒属，为有包膜的单正链RNA病毒。其包膜蛋白E1和E2存在于病毒颗粒的表面，是介导病毒吸附和进入宿主细胞的关键蛋白。随着HCV体外感染模型HCVpp和HCVcc系统的建立与完善，已经鉴定出了HCV的四个必需受体：四次跨膜蛋白CD81、B族I型清道夫受体（SR-BI）、以及紧密连接分子claudin-1（CLDN1）和occludin（OCLN）。其中，CD81是最先被鉴定出的受体，其胞外大环能够直接与HCV E2蛋白结合；结合后激活相关信号通路，引起细胞骨架肌动蛋白重建，介导病毒体向紧密连接处移动，并与共受体CLDN1相互作用，在后者帮助下完成内吞。现有研究表明，HCV细胞入侵过程依赖于细胞膜上完整的脂筏结构，然而其机制尚不清楚。本实验室前期研究发现，在HCV入侵过程中，CD81分布于细胞膜脂筏中；而胆固醇删除后改变CD81分布模式，使其定位于非脂筏区域，提示CD81脂筏分布可能为HCV细胞入侵所必需。为进一步分析CD81脂筏定位的重要作用，本实验分别构建了CD81脂筏定位和非脂筏定位的突变体真核表达质粒。这些突变体保留了CD81与HCV E2相互作用的胞外大环，而将其跨膜区和胞内区置换为脂筏蛋白（SR-BI和CD9）或非脂筏蛋白（CD71）的相应结构。继而将质粒（野生型wtCD81、CD9-81LEL、SRBI-81LEL和CD71-81LEL）转染CD81缺陷的Huh7细胞（Huh7CD81-细胞），应用流式细胞术证明，置换胞内区和跨膜区不影响CD81分子的膜上表达和空间构象。通过蔗糖密度梯度超速离心分离靶细胞脂筏后发现，wtCD81、CD9-81LEL、SRBI-81LEL定位在脂筏中，而CD71-81LEL为非脂筏定位，提示CD81跨膜区和胞内区具有脂筏定位功能。利用HCV体外感染模型HCVpp和HCVcc系统，比较各CD81突变体介导HCV细胞入侵以及感染的能力。结果显示，除非脂筏定位的CD71-81LEL外，其余脂筏定位的CD81突变体均能有效支持HCV细胞入侵。在此基础上，我们通过观察比较不同脂筏定位的CD81分子在病毒结合、GTPase Rho信号通路激活、细胞骨架肌动蛋白重建、介导病毒向细胞紧密连接处迁移并形成HCV-CD81-CLDN1等功能的影响，分析细胞膜脂筏参与HCV细胞入侵过程的分子机制。结果发现，非脂筏定位的CD71-81LEL突变体结合病毒的能力并未改变，但却不能介导HCV与共受体CLDN1相互作用。进一步通过Western blotting和激光共聚焦研究发现，CD71-81LEL不能介导HCV感染的机制是由于其定位在非脂筏区域无法激活GTPase Rho信号通路，引起细胞骨架肌动蛋白重建所致。二、脂筏对日本脑炎病毒细胞入侵的影响及其机制研究日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）又称流行性乙型脑炎病毒，属于黄病毒属（Flavivirus），和HCV一样同为黄病毒科成员，是有包膜的单股正链RNA病毒。有文献报道，细胞膜脂筏在JEV细胞入侵以及复制周期中扮演了重要角色，但其作用机制仍需进一步研究。考虑到病毒受体在病毒与脂筏相互作用中的枢纽功能，本研究将人肝癌细胞株Huh7细胞为研究对象，以JEV为感染材料，分析热休克蛋白70（HSP70）作为JEV受体在介导病毒细胞入中侵的作用，并通过观察HSP70脂筏定位对于JEV感染性的影响，探讨脂筏参与JEV入侵的分子机制。本研究通过一系列功能性实验，观察HSP70是否为JEV感染Huh7细胞所必需。首先，在病毒感染前将HSP70多克隆抗体预先与Huh7细胞孵育，JEV感染24h后，用间接免疫荧光染色检测JEV E蛋白表达，同时用空斑实验对细胞上清中的病毒进行定量。结果显示，HSP70多克隆抗体可显著抑制JEV E蛋白表达，并且这种抑制作用呈明显的剂量依赖性。空斑实验结果得出同样的结论：随着抗体浓度的增加，细胞上清中JEV感染滴度逐渐下降；在加入10μg/ml浓度抗体时，病毒滴度下降了100倍。其次，作为病毒受体必需在细胞膜表面表达，流式细胞术结果证明HSP70确实存在于Huh7细胞表面。接着，将病毒与Huh7细胞于4℃共同孵育，通过免疫沉淀HSP70，观察沉淀复合物中是否存在JEV E蛋白，结果表明HSP70抗体的沉淀复合物中确实存在JEV包膜蛋白。这些结果提示，HSP70是介导JEV感染Huh7细胞的一个重要的细胞膜分子。HSP70家族由几个高度保守的热休克蛋白组成，包括HSP70、HSC70、GRP75和GRP78。由于多克隆抗体可能对HSP70家族不同的蛋白存在交叉反应性，因此我们通过特异性的单克隆抗体来观察参与JEV感染的热休克蛋白究竟是HSP70家族的哪个成员。抗体抑制实验结果显示，在JEV感染过程中发挥作用的是HSP70，而非HSC70和GRP78。此外，我们应用特异性siRNA的抑制实验对上述结果加以验证，排除了HSP70家族其他成员作为JEV感染Huh7细胞受体的可能性。为观察具有JEV受体功能的HSP70是否定位于脂筏中，本研究对Huh7细胞进行了脂筏分离。结果显示，天然状态下，少量HSP70定位于Huh7细胞的脂筏结构中；而JEV感染后，HSP70则向细胞膜脂筏聚集，提示HSP70可被JEV招募至脂筏中。应用胆固醇删除剂干扰脂筏后，显著抑制JEV细胞入侵。通过对其机制分析，发现干扰脂筏不影响病毒结合，但改变了HSP70的脂筏定位。因此，，我们推测脂筏删除对JEV感染性的影响可能是由于抑制了HSP70的受体功能。一系列信号转导实验结果显示，JEV感染早期会激活PI3K/Akt信号通路，并且这种激活作用是由HSP70结合JEV后引起；而删除胆固醇后，HSP70对此通路的激活作用被抑制，提示HSP70发挥受体功能需依赖于完整的脂筏结构。三、脂筏对肠道病毒71型细胞入侵的影响及其机制研究肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）是单股正链RNA病毒，无包膜，属于小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）。EV71是引起婴幼儿手足口病（hand-foot-mouse disease, HFMD）的主要病原体之一。目前还没有针对EV71的特效药物，也没有预防性或治疗性疫苗问世。EV71的衣壳蛋白VP1是EV71的主要抗原表位和分型依据，也是EV71与宿主细胞上受体分子相互作用的关键区域。人胚横纹肌肉瘤细胞株RD细胞是EV71的易感细胞，宿主细胞上的B族II型清道夫受体（SR-BII）为其必需受体。许多肠道病毒，比如脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）、柯萨奇病毒（Coxsackieviruses）以及埃可病毒（Echovirus）等，在入侵靶细胞的过程中都依赖于完整的细胞膜脂筏结构。然而，细胞膜脂筏在EV71感染过程中的作用尚未见文献报道。 MβCD是最常见的干扰脂筏的药物，其作用机制是特异性的删除或驱散细胞膜上的胆固醇。Nystatin通过与胆固醇结合形成复合物而封闭脂筏，Lovastatin则能够直接抑制细胞合成胆固醇，都被用作干扰脂筏的药物而被广泛应用。本实验将不同机制干扰脂筏的药物预先与RD细胞孵育，然后加入病毒，通过以下三种方法分析脂筏对EV71感染性的影响：（1）在倒置显微镜下观察细胞病变效应；（2）qRT-PCR检测RD细胞中EV71RNA拷贝数；（3）收集细胞上清，用空斑实验检测病毒滴度。结果显示，MβCD、nystatin和lovastatin均能显著抑制EV71引起的细胞病变效应、病毒RNA拷贝数和上清中的病毒滴度，并呈明显的剂量依赖性。为进一步证明脂筏对于EV71感染性的影响，我们给RD细胞外源补充胆固醇。结果显示，胆固醇加入后能够促进靶细胞对于EV71的易感性。这些结果提示，EV71利用细胞膜脂筏感染RD细胞。为研究脂筏在EV71细胞入侵过程中的作用机制，我们首先观察MβCD是否影响病毒与受体的相互作用，检测了MβCD对膜表面SR-BII表达、病毒与SR-BII相互作用、病毒与靶细胞结合以及病毒-受体脂筏定位的影响。流式细胞术结果显示，MβCD作用前后RD细胞膜上SR-BII表达量无明显差异，结合在细胞表面的膜上病毒量也没有减少。免疫共沉淀和Western blotting结果显示，EV71与SR-BII的相互作用不受MβCD影响。然而，脂筏分离结果表明，MβCD干扰脂筏改变了病毒与SR-BII的脂筏分布。由于EV71的内吞是由SR-BII介导完成的，因此我们推测MβCD很可能影响了病毒内吞。为观察干扰脂筏对EV71内吞的影响，在MβCD处理过的RD细胞中加入病毒于4℃孵育；再将细胞转移至37℃使病毒内吞；分别在转移37℃后10min、30min和60min将细胞固定，进行间接免疫荧光染色和激光共聚焦扫描。结果显示，在MβCD处理后，胞浆中检测不到内吞的病毒颗粒，提示干扰脂筏能够抑制EV71的内吞过程。由于SR-BII并不是EV71感染RD细胞的唯一受体，还可能有其他共受体或宿主因子参与病毒入侵过程，因此脂筏调节病毒与宿主细胞相互作用的精确分子机制尚需进一步研究证明。小结本研究为脂筏参与HCV、JEV和EV71细胞入侵提供了直接证据，进一步阐明了这三种病毒细胞入侵的分子机制。置换CD81跨膜区和胞内区改变其脂筏定位的方法，为研究其他受体分子在介导病毒入侵中的作用提供了借鉴。证明了HSP70具有作为JEV感染Huh7细胞的受体功能，并且依赖脂筏介导病毒入侵。阐明了非包膜病毒EV71利用脂筏完成病毒入侵及其机制。本研究通过分析脂筏在三种RNA病毒细胞入侵的作用，找出脂筏调节病毒与宿主细胞相互作用的可能规律：作为病毒受体的蛋白质分子在正常状态下就集中定位于脂筏中，而另一些则是在宿主细胞接触病原体后迁入脂筏，因此脂筏可能通过富集受体蛋白和相关分子，为病原体与靶细胞的相互作用提供平台，是多种病毒入侵靶细胞优先选择的“大门”。这为以脂筏为靶点设计抗病毒药物提供了新思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

【参考文献】