HIV整合酶对链转移抑制剂的易感性和耐药性研究以及新型抗整合酶单域抗体的研发

发布时间：2018-02-23 20:19

  本文关键词： HIV 整合酶 链转移抑制剂 耐药性 易感性 单域抗体　出处：《华东师范大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy, HAART)能够有效地延缓HIV/AIDS患者的疾病进程,改善其生存状况。但由于耐药性病毒的不断出现以及HIV潜伏池(latent reservoir)等多种原因,抗逆转录病毒新药的开发始终受到极大的重视。首个整合酶链转移抑制剂(integrase strand transfer inhibitor, INSTI), raltegravir (RAL),于2007年十月由美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准上市,其疗效足以同已上市的任何抗逆转录病毒药物相媲美,因而从实践上验证了整合酶是一个极好的抗病毒治疗靶点。整合酶(integrase,IN),逆转录酶(reverse transcriptase, RT)及蛋白酶(protease, PR)是HIV病毒生活史中三个关键酶。逆转录病毒DNA整合到宿主染色体是病毒复制周期中的重要步骤。HIV基因组通过整合而得以在宿主细胞中存档。而且含耐药性突变HIV基因组的存档可致使永久性的预先抵消抗逆转录病毒药物或所有类别药物的作用,因此无法持久的抑制病毒和使病人回复稳定的健康状态。另外,在人体中不存在己知的整合酶同源蛋白,所以整合酶抑制剂很可能不会干扰正常的细胞功能,从而使得该药物具有毒性低和特异性高的特点。 HIV-1整合酶由病毒pol基因3’末端编码,含288个氨基酸残基,在体内以多聚体形式存在及作用。整合酶分子量为32kDa,折叠成3个结构域,即N末端结构域(N-terminal domain, NTD),核心催化域(core catalytic domain)和C末端结构域(C-terminal domain, CTD)。N末端结构域由1-49位氨基酸残基组成,形成一个His2Cys2(HHCC)基序,结合锌离子形成锌指结构,促进整合酶多聚化并增强其催化活力。核心区域由第50-212位氨基酸残基组成,是整合酶催化部位。其中3个高度保守的酸性氨基酸残基结合两个二价金属阳离子(Asp64, Asp116, Glu152, DDE)组成酶的活性中心。C末端结构域由213-288位氨基酸残基组成,是与DNA结合的部位。其总体结构与SH3(SRC homomlogy3domain)区域相似。C末端结构域是整合酶中保守度最小的区域。整合过程由位于前整合复合物(preintegration complex, PIC)中的整合酶催化两个独立反应而完成。第一个反应为3’加工(3'-processing)。整合酶与HIV DNA长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)组装成一个稳定的DNA/酶复合物。在整合酶的催化下,病毒LTR3’末端的GT双核苷酸被切除,暴露出3’CA末端。第二步反应为链转移(Strand transfer)。该反应发生在前整合复合物穿过核孔进入细胞核后,切割宿主DNA使之产生一个交错切口,然后病毒DNA的3’末端和5’末端分别连接到宿主DNA的5’末端和3’末端上,从而使病毒DNA整合到宿主基因中。病毒DNA与宿主DNA之间的裂痕由宿主细胞内的酶进行修补。 RAL对HIV深度感染的病人具有快速持久的病毒抑制作用。而且由于药物作用机理不同,RAL能够同样有效地抑制其他药物种类的耐药毒株。RAL在2009年六月被批准用于一线抗病毒治疗,目前处在无抗病毒治疗史患者的临床Ⅲ期研究中,其中包括每日服用的剂量。第二个高效的链转移抑制剂elvitegravir (EVG, JTK-303/GS-9137)目前处于有抗病毒治疗史患者的Ⅲ期临床研发中,同时也作为固定剂量复合药物的组分用于无抗病毒治疗史患者的Ⅱ期临床研究。已有的资料表明EVG具有高效的抗病毒效力和低毒性。根据基因的重要自然变异,HIV-1被分为多个亚型,流行重组体(circulating recombinant form, CRF)或者独特重组体(unique recombinant form, URF)。大多数现有的抗逆转录病毒药物都是针对HIV-1B亚型开发和检测的。但全世界范围内大约90%的HIV/AIDS病人感染的为非B亚型病毒。HIV-1非B亚型病毒对整合酶链转移抑制剂的体内和体外药物易感性评估很少被报道。在非B亚型病毒中,流行重组体CRFO2-AG (circulating recombinant form A/G)亚型的感染率在西非地区极高,近年来在其他国家如法国也越来越普遍。已有的酶学和病毒学数据表明,HIV-1非B亚型基因组中的自然发生多态性能够影响病毒对某些药物的易感性。例如,A/G重组亚型对蛋白酶抑制剂的易感性基线(baseline susceptibility)较低,而且某些A/G病毒株对核苷类逆转录酶抑制剂abacavir的易感性低。对整合酶氨基酸序列的进行的生物信息学分析表明,CRF02-AG亚型基因组的多态性,特别其中13个位点上的重要氨基酸变异(K14R, V31I, L101I, T112V, T124A, T125A, G134N, I135V, K136T, V201I, T206S, L234I及S283G)可能会影响整合酶的构象,以及抑制剂和靶蛋白之间的相互作用,从而影响该亚型病毒整合酶对抑制剂的药物易感性。所以有必要比较整合酶链转移抑制剂对HIV-1B亚型和CRF02-AG亚型的效用,以确定CRF02-AG亚型基因组中的自然发生多态性是否影响其对整合酶链转移抑制剂的易感性,从为临床治疗提供重要指导信息。因此第一部分工作在体外评估了来源于无抗病毒治疗史CRF02-AG感亚型感染者的整合酶对最新整合酶链转移抑制剂的易感性。 我们利用从尚未接受整合酶抑制剂治疗的HIV-1CRF02-AG亚型感染者的血液样本中分离出的病毒DNA,进行扩增,克隆以及测序,分离得到分别含有2个到7个上述重要氨基酸变异的4条整合酶编码序列。随后同步进行了体外实验和生物信息学建模。我们的体外研究结果表明,CRF02-AG亚型病毒基因组中的自然发生多态性并不显著影响整合酶在体外对病毒DNA的结合能力,亦不影响其3’加工和链转移催化能力。同时进行的生物信息学研究得到的结论与体外实验一致。利用游离以及结合病毒DNA的整合酶模型,生物信息学研究表明两种亚型的整合酶之间并不存在明显的结构差异。先前学者对HIV-1B和C亚型重组整合酶的研究也获得了类似结论。 生物信息学研究表明,大部分的重要变异氨基酸远离整合酶活性中心,虽然第134和136位的两个氨基酸靠近活性位点,但由于暴露于溶剂中,因此并不严重影响CRF02_AG整合酶的构象。而从整合酶模型中观察到的两种亚型整合酶催化环所存在的微弱差异也通过体外3’加工动力学实验证明：该差异并不足以影响整合酶活性。 此外,我们的结果表明这些氨基酸变异也不影响整合酶和抑制剂间的相互作用以及抑制剂的活性。在体外实验中,两种亚型整合酶分别受到3种所测试药物(RAL,EVG及L-731,983)在相近程度上的抑制。该结果吻合于生物信息学建模分析,后者揭示这3种整合酶抑制剂分别对两种亚型整合酶的结合及定位模式并无差异。两种亚型整合酶和抑制剂作用模式相一致的结论得到下述数据的支持：被认为参与和RAL相互作用的HIV-1整合酶残基C65,T66,H67,N117,F121,T122,A128,G149,及K159在各亚型HIV-1病毒中高度保守。该结果验证了先前报道的B和C亚型整合酶不具有药物易感性差异的结论。其他的体外研究也发现,从无整合酶抑制剂治疗史的HIV-2患者体内分离出的毒株亦具有类似的表型易感性。 不同于A/G重组亚型病毒对蛋白酶抑制剂的低易感性基线,以及某些A/G分离株对abacavir下降了的易感性,CRF02_AG亚型整合酶的易感性甚至略微高于B型整合酶。尽管酶学和病毒学数据支持这样的观点：各种非B亚型中存在的自然发生多态性可能影响病毒对抗逆转录病毒药物的易感性,且整合酶编码区含有的变异率与蛋白酶相当,但是这种较高程度的流行多态性却几乎不影响对整合酶抑制剂的易感性,亦甚少与高水平的耐药性相关。 另外,在整合酶第140,148,151,157和160位密码子上观察到的自然变异和特征多态性提示,CRF02_AG亚型整合酶可能对获得G140S,G140C和V151l耐药突变具有较高的基因屏障(genetic barrier)。因此,整合酶抑制剂为HIV-1CRF02-AG亚型患者提供了优秀的治疗选择。 值得一提的是,我们所分离得到的一条整合酶编码基因含有一个重要的整合酶抑制剂耐药突变Q148K。因为该序列来源于未经整合酶抑制剂治疗的病人,所以该突变的获得途径尚不明了。先前的报道中也曾发现类似的情况：从未经整合酶抑制剂治疗病人中分离出含有整合酶耐药突变Q148H(G亚型)和Q148K(CRF02_AG亚型)的病毒。·HIV-2在西非地区高度流行,且近二十年逐步向欧洲扩散。虽然目前上市的抗逆转录病毒药物多达7大类23种,但是可用于治疗HIV-2感染的药物种类却相对较少。例如,非核苷酸类抑制剂和融合抑制剂不能有效地抑制HIV-2感染；HIV-2对某些蛋白酶抑制剂的敏感性不高,且由于其产生耐药突变的基因屏障相对较低,因此可能更快的产生耐受蛋白酶抑制剂的HIV-2突变株。因此,开发基于抗HIV-2高效药物种类的新型治疗方法尤为重要。整合酶链转移抑制剂是治疗HIV-2患者的一类高效药物。RAL能有效抑制HIV-2,且表型易感性接近于HIV-1(尽管这两种整合酶的氨基酸序列差异高达40%左右)。因此该类药物为HIV-2感染者提供了更多的药物选择。 然而,和其他种类的药物一样,RAL的耐药性通过pol基因中整合酶编码区的选择性突变而分别在体内和体外快速出现,大幅度降低了病毒对抑制剂的易感性。在HIV-1中,3条分别涉及N155,Q148和Y143的主要途径己被确认可导致RAL的体内耐药性。使用RAL治疗HIV-1时所产生的病毒学失败主要与单独出现的(或者与其他次要耐药性突变共同出现的)N155H或Q148H/K/R这两条独立的耐药性途径的发生有关。次要突变,如G140S,虽然本身不影响药物易感性或者影响极小,却能提高表型耐药性或者病毒的适应性。含Y143突变的第三条耐药性途径相对发现的较少,且其出现晚于N155和Q148途径。尽管已发现60多个突变与整合酶链转移抑制剂耐药性相关,但仅Q148,N155或Y143这些重要单突变就足以在体外大幅度降低整合酶对抑制剂的易感性。最近,对来源于病毒学失败患者的病毒群体所进行的表型研究揭示,HIV-2对RAL的耐药性很可能也与Q148,N155或Y143这三种主要耐药突变相关。通过对含有定点突变的重组整合酶进行体外实验,HIV-1整合酶对RAL的耐药性途径已经获得验证,但是尚未有类似的研究对HIV-2整合酶耐药性途径进行验证。HIV-1和HIV-2整合酶在核酸水平上仅有40%相同,在氨基酸水平上的相似性为65%,从而提示可能存在酶对抑制剂的应答,尤其是耐药性产生机制方面的差异。所以第二部分工作围绕HIV-2临床分离病毒其重组整合酶的体外催化活性和RAL耐药性而展开。 对来源于未经整合酶抑制剂治疗患者的整合酶序列进行克隆及分析后发现：三个HIV-2B型整合酶在C末端存在重要的氨基酸变异,且蛋白长度不一。虽然导致B型整合酶蛋白长度不同的原因尚且不明,但观察发现是归因于核苷酸序列长度的差异,而不同于先前病毒群体测序研究中的推测(该推测认为整合酶蛋白长度差异由读码框中的终止密码子导致)。这三个整合酶的催化能力类似且接近HIV-1整合酶的体外催化活性,表明C末端的差异并不影响酶的活性。在体外,HIV-2整合酶催化的链转移反应受RAL抑制的程度亦与HIV-1相当,该结果与先前报道的HIV-1和HIV-2对该类抑制剂具有类似的表型易感性一致。另外,该结果也提示RAL与这两种整合酶的相互作用模式类似。HIV-1整合酶中,推测与RAL相互作用的残基C65,T66,H67,N117,F121,T122,D128,G149及K159在HIV-2中完全保守,该观点为上述实验结果提供了根据。 根据文献中HIV-2病毒群体测序所提示的三个主要耐药突变Q148, N155及Y143,以及本研究中序列克隆分析所鉴定的E92Q(与N155H途径和Y143C途径相关),T97A(与Y143C途径相关),我们对临床分离病毒的整合酶编码序列进行了克隆分析,发现了耐药模式E92A/T97A/N155H,G140S/Q148R和E92Q/143C,从而确定这三种主要耐药途径在HIV-2中的存在。在体外实验中,这三个重组整合酶被证实高度耐受RAL,因而确定耐药性由整合酶编码序列中的突变引起。随后通过定点突变野生型整合酶序列,我们发现N155H单突变和G140S/Q148H双突变足以在体外引起HIV-2对RAL的高度耐药性。在G140S/Q148H模式中,Q148H在引起高水平RAL耐药性的同时导致整合酶催化能力的严重缺陷,而次要突变G140S的产生则能够修复催化活性,虽然G140S自身并不导致耐药性。这一结论与我们先前对于HIV-1的体外研究完全一致。在HIV-1和HIV-2整合酶中均存在的G140S/Q148H双突变模式基于整合酶自身的蛋白结构,提示逆转录病毒整合酶中的这两个保守残基间存在着密切的相互作用。 单个N155H突变导致的耐药水平与含E92A/T97A/N155H突变的临床分离株非常接近,这提示E92A和T97A次要突变在N155H途径中对耐药水平并无重要贡献,该推测与在整合酶中引入E92A和T97A单突变并不导致耐药性的实验结果相符合。和表型研究文献一样,这些结果均表明：在该途径中N155H是主要的(即便不是唯一的)耐药突变。另外该结果也为先前病毒群体研究中N155H途径主要出现于HIV-2B亚型的推测提供了支持。 Y143C/R被认为是导致HIV-1对RAL耐药性的重要突变之一。我们之前的工作也同样表明RAL并不能抑制含该单突变的重组HIV-1整合酶的体外催化能力。出乎意料的是,Y143C单突变却不足以引起HIV-2整合酶的耐药性,从而排除了其为导致HIV-2整合酶耐药性之充分条件的可能。由于在临床分离病毒的整合酶序列中还发现了E92Q突变,因此我们在同时存在Y143C突变的情况下,对E92Q突变产生的影响作了进一步研究。在HIV-1对RAL的耐药机制中,E92Q被认为是N155H和Y143C途径中的次要突变。E92Q在体外实验中能引起HIV-1整合酶的耐药性,尽管耐药水平低于N155H或Q148R。然而在HIV-2整合酶中E92Q单突变亦不足以引起体外耐药性。但是,通过在野生型整合酶中定点突变获得的Y143C/E92Q双突变株在体外实验中具有耐药性,这表明尽管Y143C或E92Q单突变均不足以引起对RAL的耐药性,但是他们的同时存在构成了HIV-2耐药途径之一。所以异于HIV-1,此途径在HIV-2中需要至少两个突变才足以产生耐药性。从这点看来,先前对耐药病毒进行克隆分析的文献中所提到的与Y143C相关的另外两个突变Q91R和T97A也值得进一步研究。二者能够影响到邻近E92的残基。最近的结构学研究表明RAL能与Y143的侧链建立联系,我们推测在HIV-2中,此联系的缺失并不足以大幅度减弱RAL对整合酶的结合；E92等突变参与的对RAL结合位点的再次修饰很可能是产生耐药性所必需的。 Y143C途径的产生被推测为是源于N155H途径的一个较晚发生的转变。我们的数据表明高,且由于其产生耐药突变的基因屏障相对较低,因此可能更快的产生耐受蛋白酶抑制剂的HIV-2突变株。因此,开发基于抗HIV-2高效药物种类的新型治疗方法尤为重要。整合酶链转移抑制剂是治疗HIV-2患者的一类高效药物。RAL能有效抑制HIV-2,且表型易感性接近于HIV-1(尽管这两种整合酶的氨基酸序列差异高达40%左右)。因此该类药物为HIV-2感染者提供了更多的药物选择。 然而,和其他种类的药物一样,RAL的耐药性通过pol基因中整合酶编码区的选择性突变而分别在体内和体外快速出现,大幅度降低了病毒对抑制剂的易感性。在HIV-1中,3条分别涉及N155,Q148和Y143的主要途径已被确认可导致RAL的体内耐药性。使用RAL治疗HIV-1时所产生的病毒学失败主要与单独出现的(或者与其他次要耐药性突变共同出现的)N155H或Q148H/K/R这两条独立的耐药性途径的发生有关。次要突变,如G140S,虽然本身不影响药物易感性或者影响极小,却能提高表型耐药性或者病毒的适应性。含Y143突变的第三条耐药性途径相对发现的较少,且其出现晚于N155和Q148途径。尽管已发现60多个突变与整合酶链转移抑制剂耐药性相关,但仅Q148,N155或Y143这些重要单突变就足以在体外大幅度降低整合酶对抑制剂的易感性。最近,对来源于病毒学失败患者的病毒群体所进行的表型研究揭示,HIV-2对RAL的耐药性很可能也与Q148,N155或Y143这三种主要耐药突变相关。通过对含有定点突变的重组整合酶进行体外实验,HIV-1整合酶对RAL的耐药性途径已经状得验证,但是尚未有类似的研究对HIV-2整合酶耐药性途径进行验证。HIV-1和HIV-2整合酶在核酸水平上仅有40%相同,在氨基酸水平上的相似性为65%,从而提示可能存在酶对抑制剂的应答,尤其是耐药性产生机制方面的差异。所以第二部分工作围绕HIV-21临床分离病毒其重组整合酶的体外催化活性和RAL耐药性而展开。 对来源于未经整合酶抑制剂治疗患者的整合酶序列进行克隆及分析后发现：三个HIV-2B型整合酶在C末端存在重要的氨基酸变异,且蛋白长度不一。虽然导致B型整合酶蛋白长度不同的原因尚且不明,但观察发现是归因于核苷酸序列长度的差异,而不同于先前病毒群体测序研究中的推测(该推测认为整合酶蛋白长度差异由读码框中的终止密码子导致)。这三个整合酶的催化能力类似且接近HIV-1整合酶的体外催化活性,表明C末端的差异并不影响酶的活性。在体外,HIV-2整合酶催化的链转移反应受RAL抑制的程度亦与HIV-1相当,该结果与先前报道的HIV-1和HIV-2对该类抑制剂具有类似的表型易感性一致。另外,该结果也提示RAL与这两种整合酶的相互作用模式类似。HIV-1整合酶中,推测与RAL相互作用的残基C65,T66,H67,N117,F121,T122,D128,G149及K159在HIV-2中完全保守,该观点为上述实验结果提供了根据。 根据文献中HIV-2病毒群体测序所提示的三个主要耐药突变Q148, N155及Y143,以及本研domain antibody, sdAb),亦称为VHH抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH)。单域抗体的晶体和水溶性结构由2个β片层组成支架,类似普通抗体的VH免疫球蛋白折叠。 单域抗体分子量为13kDa。较普通抗体而言,单结构域的特性使之具有一些独特的性质,比如易表达,在Ecoli,真菌和酵母中均能高水平分泌。单域抗体在缺失VL区的情况下仍具备了特异性结合抗原的能力以及高亲和力。单域抗体的抗原结合环比普通抗体VH大,CDR3区也更长。人和小鼠VH的CDR3平均长度分别为12和9个氨基酸,而单域抗体则为16-18个氨基酸。这使得它能够深入结合蛋白上的裂隙和空腔。另外,单域抗体非常稳定且水溶性高,在不形成二硫键的情况下仍具有功能。而VH结构域单独表达时通常形成包涵体,或暴露的疏水域相互黏附。普通抗体的FR2中,4个疏水性氨基酸残基(V37,G44,L45和W47)与VL相互作用,而在单域抗体中突变为亲水性残基(F37,E44,R45和G47),从而提高了水溶性。一些单域抗体能耐高温,且其构像具有高度的稳定性以及可逆的去折叠能力。单域抗体还显示出在蛋白酶和极度pH环境中的高稳定性。另外,通过比较人类VH3基因序列与骆驼的VHH胚系基因序列,发现二者具有高度的同源性；小鼠B或T细胞亦缺乏对VHH抗体的免疫应答。 由于上述的优点,靶向HIV病毒不同组分的单域抗体可以开发为抑制病毒复制的新药物。同时,单域抗体也可以作为有效工具以研究靶蛋白在病毒生命周期不同阶段所执行的分子功能。一些抗HIV病毒蛋白的单域抗体已经成功开发,比如靶向HIV-1Rev或Vif的单域抗体在细胞实验中具有抗病毒活性。最近报道的特异性单域抗体能以高亲和力结合HIV-1Nef,并且在体内和体外实验中均抑制Nef的关键生物功能。因此,考虑到整合酶在病毒生活史中的关键作用,第三部分的主要研究目的是利用单域抗体,即骆驼科重链抗体高变区,开发靶向整合酶的特异性单域抗体。 在本研究中通过噬菌体展示技术,特异靶向整合酶的单域抗体被筛选获得。通过免疫羊驼,特异性扩增VHH编码区以及克隆于噬菌粒,展示所有VHH表型的噬菌体展示库得以建立。特异性抗整合酶单域抗体经过几轮筛选而被鉴定。在体外实验中,重组抗整合酶单域抗体具有特异性的抗原识别能力。另外,除识别HIV-1整合酶,这些单域抗体同样能够识别其他逆转录病毒整合酶,如HIV-2整合酶,人类泡沫病毒HFV整合酶。这种广谱的识别能力推测是得益于逆转录病毒整合酶之间,特别是其活性位点间的高度保守性(而这种保守性亦使得HFV整合酶被用作研究HIV整合酶结构的理想原型)。 值得注意的是,这些单域抗体对HIV-1整合酶突变株G140S/Q148R同样具有很好的抗原识别能力。G140S/Q148R是导致整合酶链转移抑制剂耐药性的主要突变之一,可引起raltegravir和elvitegravir等药物易感性的急剧减低。该结果提示,由于单域抗体的抑制机制与现有链转移抑制剂不同,该抗体是一种值得开发的抗逆转录病毒试剂。 另外,我们对单域抗体是否干扰整合酶/表皮生长因子p75复合物的形成进行了研究。表皮生长因子p75(LEDGF/p75)是至今为止研究最为深入的前整合复合物所含细胞辅助因子。表皮生长因子p75在前整合复合物中与整合酶相互作用,协助复合物入核,并在染色体牵引,基因组内特异位点的整合中起重要作用。但是,体外实验表明重组单域抗体并不能影响整合酶与表皮生长因子p75形成复合体。推测是由于鉴定得到的单域抗体在整合酶上的结合位点并不位于(或邻近)整合酶/表皮生长因子p75的相互作用位点。 体外酶活性实验表明,单域抗体不能高效的抑制整合酶催化能力(半数抑制浓度IC50约为30μM)。对表达抗体的细胞所进行的病毒感染实验表明,胞内表达的抗整合酶单域抗体也不足以抑制HIV的复制。因为对HIV复制的有效抑制取决于对靶蛋白相关功能区的中和,所以这些单域抗体的在整合酶上的结合位点可能并不处于酶的活性位点；或者这些抗体的亲和力并不足以中和抑制整合酶活性以及病毒复制(即使抗体的效用并不与其亲和力直接相关)。 另外,在细胞实验中也未能观察到整合酶和单域抗体的共定位。整合酶趋向于在核内表达,而单域抗体则大多表达于细胞质中。该现象与先前抗整合酶scFv的研究结果类似：抗整合酶scFv表达于细胞质中,被排除于核内,而融合表达Tat核定位信号区的抗整合酶scFv则定位于细胞核中,尤其是核内膜周围。 值得注意的是,融合表达增强型绿色荧光蛋白的抗整合酶单域抗体的胞内表达水平极高。这种高水平的表达归功于该抗体只含有单个结构域,无需与其他链或者区域配对,亦无需连接肽段,所以能够在还原性环境(如真核细胞的胞质和核内)有效地折叠为具有活性的形式。 此外,我们的实验还表明,偶联抗原于环氧树脂颗粒上所进行的噬菌体展示库筛选是一个获得高多样性结合物的有效方法。 虽然本实验中鉴定得到的抗整合酶单域抗体不足以有效抑制HIV感染,但因此该抗体能够在体外特异性识别整合酶的同时,保持酶的催化能力；另外作为一个小蛋白片段(约13kDa),单域抗体很可能不影响所结合整合酶的空间构象,因此该单域抗体可开发为整合酶俘获试剂而运用于诊断平台或纳米生物感应器。等离子表面共振成像(SPRi)技术能够实时提供分子间结合,生物大分子相互作用及动力学上的详细数据。我们利用SPRi的初步研究结果表明,体外固定化的单域抗体能够特异性的结合重组整合酶,且具有较好的亲和力。该方法可望进一步优化及开发为筛选整合酶药物的高通量平台以及用于药物／整合酶作用机制的研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R512.91;R392

【共引文献】

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本文编号：1527474