脂肪基质干细胞分化为多巴胺能神经元过程中Wnt3a表达的变化

发布时间：2018-02-24 05:06

本文关键词： 脂肪基质细胞神经干细胞 Wnt信号通路 Wnt3a 多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶　出处：《河北联合大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的: 通过观察脂肪组织来源的基质干细胞(ADSCs)向多巴胺能神经元分化过程中的wnt3a蛋白的表达变化,探讨Wnt3a在定向诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化过程中的作用,进一步研究wnt信号通路对神经干细胞分化的影响,从而为临床细胞移植治疗技术提供新的细胞来源及细胞学基础。方法: 1.脂肪源性基质细胞的培养无菌条件下取2～4周SD大鼠腹股沟脂肪,脂肪基质细胞的分离培养参照Zuk PA的方法进行,常规细胞培养,并换液传代。倒置相差显微镜下连续观察原代及传代后的细胞生长情况和形态变化,并照相记录。 2.脂肪源性基质干细胞向神经细胞的分化将第三代的ADSCs采用胰酶消化,传第四代细胞至已预先放入无菌盖玻片的6孔培养板中,制备细胞爬片,至细胞长成80%融合时,去除培养液,加入诱导培养基。实验分为5组进行,分别为: A组为神经诱导培养基(NIM)诱导8小时组,B组为NIM诱导16小时组,C组为NIM诱导24小时组,D组为NIM诱导32小时组;对照组为普通培养基培养。于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态变化,并照相记录。 3.神经细胞特异性标志和神经递质合成过程中关键酶的检测于各规定时间点采用免疫组化法和间接免疫荧光法检测神经前体细胞的特异性标志神经巢蛋白(Nestin),神经细胞的特异性标志神经特异神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管联合蛋白2(MAP2)和多巴胺合成过程中的关键酶酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况。 4. Nurr1、TH、Wnt3a蛋白的Real Time-PCR检测采用Trizol一步法提取诱导后细胞总RNA,紫外分光光度仪测定RNA的A260/A280值。通过逆转录反应从总RNA中的mRNA获得cDNA,再经PCR反应扩增目标基因:多巴胺能神经元前体细胞特异性标志Nurr1、多巴胺合成过程中的关键酶酪氨酸羟化酶TH和Wnt信号通路起始蛋白Wnt3a的表达情况。PCR总反应体系为10μl,反应条件为:94℃20sec,53℃20sec,60℃40sec,40cycles。荧光曲线结果应用Rotor—Gene 3000实时荧光PCR仪的Comparative Delta-delta CT法进行分析,每一组应用六个样本检测其基因表达结果。 5.对诱导分化后的细胞进行HE染色以观察诱导后细胞形态。 6.统计学处理所有数据在录入前进行严格的校对,以Excel数据库整理后采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。所得数据以均数±标准差表示。同一组内不同时间点间均数的比较采用单因素方差分析,以p0.05为差异在统计学上有显著性意义。采用Microsoft Excel软件作图。结果: 1.原代和传代细胞生长情况和形态变化原代细胞刚接种后在倒置显微镜下观察,呈圆形亮点,可见大量油滴及少量结缔组织纤维,4小时左右即有少量细胞贴壁,24小时首次换液后观察,未贴壁细胞及杂质细胞被去除掉,大量成活细胞贴壁,贴壁细胞呈三角形、多角形、类圆形或类梭形,并逐渐开始伸展、分裂、呈梭形或多角形,3～5 d迅速增殖,5～7 d后细胞呈集落生长,集落大小不一,含数十个至数百个细胞不等,并含有少量圆形或卵圆形细胞混杂生长。传代细胞初始形态呈圆形,悬浮状态,并很快贴壁,刚贴壁细胞呈梭形、多角形或类圆形,3～4小时后所有成活细胞完全贴壁,均匀分布,与原代细胞相比,细胞形态更为单一,呈梭形,且增殖速度明显加快,出现多个漩涡状生长区, 4～5天即长满瓶底。 2.诱导后细胞生长情况和形态变化加入诱导培养基1～2小时内,各组细胞形态即发生显著变化。细胞体积缩小,胞质以胞核为中心收缩并向两侧延长,细胞体逐渐形成球形并形成突起,立体感增强,折光性增加。随着时间进展,经NIM诱导后,ADSCs可分化为神经细胞,在一定的时间内,分化的神经细胞数逐渐增加,形成双极或多极细胞,细胞突起互相交织成网。 3.神经细胞特异性标志和神经递质合成过程中关键酶的表达 (1)诱导分化完成后,对照组未发现Nestin的阳性表达,其余各组均有Nestin的阳性表达,且以D组最高,A、B、C、D组间比较差异均有显著统计学意义(p0.05)。 (2)诱导分化完成后,对照组未发现NSE的阳性表达,其余各组均有NSE的阳性表达,且以D组表达最高,A、B、C、D组间比较差异均有显著统计学意义(p0.05) (3)诱导分化完成后,对照组未发现MAP2的阳性表达,其余各组均有MAP2的阳性表达,且以D组表达最高, A、B、C、D组间比较差异均有显著统计学意义(p0.05)。 (4)诱导分化完成后,对照组未发现TH阳性表达,其余各组均有TH的阳性表达,且以D组表达最高,A、B、C、D组间比较差异均有显著统计学意义(p0.05)。 (5)间接免疫荧光检测结果,除对照组外,其余各组均有TH表达。 4. HE染色结果诱导后的ADSCs经HE染色可见典型的双极或多极细胞,中间可见蓝色的细胞核,胞浆及突起为红色。细胞形态呈现典型神经元样改变。 5. Real Time-PCR检测Nurr1、TH和Wnt3a的表达 ADSCs诱导分化后细胞的Nurr1、TH、Wnt3a基因mRNA的表达结果:应用NIM诱导剂对ADSCs进行诱导,在诱导后相同基因的mRNA在不同组间的平均相对浓度比较,差异均具有明显统计学差异(p0.05)。对Wnt3a、TH、Nurr1 PCR结果进行相关性分析,Wnt3a分别与TH、Nurr1变化一致,呈正相关(p0.05 rTH=0.957,rNurr1=0.979)。结论: 1.经NIM诱导,ADSCs可分化为多巴胺能神经元,各组分化为的神经细胞阳性率比较,D组最高,组间比较差异有统计学意义(p 0.05)。 2. Real Time-PCR技术检测,除对照组外,其余各组均有Nurr1、TH和Wnt3a mRNA的表达,且各标志物均以D组表达最高,各标志物组间比较,差异均有显著统计学意义(p 0.05)。 3. Wnt3a可能促进神经干细胞向多巴胺能神经元细胞分化,分化后的细胞能表达多巴胺能神经元的特异性标志物。
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【学位授予单位】：河北联合大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329.28

【参考文献】