白念珠菌耐药相关蛋白Rta2p与脂筏关系研究

发布时间：2018-02-24 03:29

  本文关键词： 白念珠菌 脂筏 Rta2p 咪康唑　出处：《第二军医大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：白念珠菌（Candida albicans）是目前深部真菌感染最为普遍的病原菌之一，目前治疗白念珠菌感染临床应用较多的是唑类药物，随着长期大量广泛地应用，耐药菌株不断产生，由耐药导致的治疗失败越来越多。因此，需要我们寻找白念珠菌对唑类药物的耐药机制，为药物治疗提供依据。在白念珠菌中，，脂筏（lipid rafts）也叫做去垢剂不溶膜（detergent-resistant membranes, DRMs），是细胞膜上富含麦角甾醇和鞘脂的区域，其中还包含许多具有重要功能的蛋白，在许多细胞活动中发挥重要的作用。我们实验室前期的研究发现，在白念珠菌中，RTA2是钙调神经磷酸酶介导的唑类药物耐药的必须基因，并且Rta2p参与了鞘脂成分—长链碱二氢鞘氨醇从细胞膜内向细胞膜外转运。因此，我们推测Rta2p可能是通过影响脂筏发挥对唑类药物的耐药作用。 在本实验中，我们构建了Rta2p-GFP的融合表达菌，通过激光共聚焦显微镜观察，发现Rta2p可以和脂筏的主要组成成分麦角甾醇共定位，且这种定位会被麦角甾醇和鞘脂合成通路的抑制剂破坏。接着我们用加入去垢剂TritonX-100的密度梯度超速离心方法提取脂筏，利用Western blot方法考察分离的脂筏，发现Rta2p与公认的脂筏的标志性蛋白（Pma1p and Gas1p同源蛋白）都定位在脂筏区域，而这种定位也会被麦角甾醇和鞘脂合成通路的抑制剂破坏。为了研究RTA2缺失对脂筏的影响，我们首先通过气－质联用的方法测定了亲本菌，缺失菌的总甾醇含量，及脂筏区，非筏区麦角甾醇的百分含量，用Filipin染色观察麦角甾醇分布，结果显示，两株菌之间都没有显著差异，说明RTA2缺失并不影响麦角甾醇的总含量，在脂筏区的含量和分布。我们又用蛋白质组学和Western blot方法发现Rta2p主要影响10个脂筏区域蛋白在脂筏区域的分布。其中，有5个蛋白(Pma1p, Gas1p同源蛋白, Erg11p, Pmt2p和Ali1p)已经被报道存在于脂筏区域，而且其中的Erg11p还是白念珠菌中众所周知的唑类药物的靶蛋白。总而言之，我们的结果说明Rta2p主要定位在脂筏区域，而且会影响脂筏区域某些特定蛋白的锚定，其在脂筏分布还会被麦角甾醇和鞘脂合成通路的抑制剂破坏。 不同于常见的唑类药物的作用机制，咪康唑除了能够抑制麦角甾醇合成通路外，还能诱导活性氧(ROS)3在细胞内累积，导致真菌细胞死亡，在这之前，还会诱导细胞骨架肌动蛋白的聚集。有研究发现在酿酒酵母中，脂筏在咪康唑发挥抗真菌活性的过程中十分重要。我们想要考察在白念珠菌中是否有相同的机制，以及RTA2缺失是否会影响咪康唑的抗真菌活性。 在本实验中，我们首先通过点板实验（Spot assay）发现，在白念珠菌中RTA2缺失不会影响白念珠菌对咪康唑的敏感性。接着我们在野生型白念珠菌中考察脂筏抑制剂对（1）测定咪康唑抗真菌活性（2）咪康唑诱导的活性氧累积量（3）咪康唑诱导的肌动蛋白聚集的影响，发现用麦角甾醇或者鞘脂合成通路抑制剂（甲基β环糊精或依地福新）破坏脂筏会抵抗咪康唑的抗真菌活性，以及其诱导的活性氧累积和肌动蛋白聚集。为了探索Rta2p是否参与了咪康唑这一抗真菌活性机制，我们同时对RTA2缺失菌(rta2Δ/Δ)做了与野生菌相同的实验。我们发现在单用咪康唑的情况下，RTA2缺失菌和亲本菌的生存率，活性氧累积量以及肌动蛋白聚集情况都没有显著差别。但在同时加入脂筏抑制剂（甲基β环糊精或依地福新）后，RTA2缺失能够与脂筏抑制剂协同抑制咪康唑发挥抗真菌作用。综上所述，Rta2p是一个脂筏区蛋白，能够通过影响某些脂筏区蛋白分布发挥作用。还能与脂筏抑制剂协同抑制咪康唑发挥抗真菌活性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R379

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本文编号：1528710