基于金纳米颗粒和发夹型核酸探针电化学检测DNA甲基化酶

发布时间：2018-02-25 05:04

本文关键词： 电化学传感器金纳米颗粒发夹型探针 DNA甲基化酶抑制剂　出处：《湖南大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：DNA甲基化是表观遗传中最主要的作用方式，其在基因表达调控、基因组印迹、胚胎发育、维持正常细胞功能等过程中起着极其重要的作用。人类许多重大疾病如癌症、遗传性疾病都与DNA甲基化以及甲基化酶的活性密切相关。因此，研究DNA甲基化过程和分析DNA甲基化酶活性，受到了研究者们的广泛关注。由于传统的检测方法存在耗时、不连续、大多需要放射性标记等缺点，于是发展新的简便、经济、灵敏的甲基化监测手段和甲基化酶检测方法便已成为生化分析和临床诊断等领域愈加迫切的需求。电化学生物传感器具有灵敏度高、操作简便、响应快速、易于微型化、测试费用低等优点，在各种目标物的检测中得到了广泛的研究和应用，也为DNA甲基化和DNA甲基化酶的研究提供了新的契机。本论文以甲基化酶活性的高灵敏检测为目标，基于核酸分子探针及纳米材料信号放大作用构建了不同的电化学生物传感器，主要包括以下三方面的研究工作：一、基于金纳米颗粒信号放大作用的DNA甲基化酶免标记电化学检测利用DNA功能化金纳米颗粒的信号放大作用，发展了一种便捷、高灵敏电化学检测Dam甲基化酶活性的新方法。首先在金电极上修饰单链DNA，当不存在Dam甲基化酶时，互补DNA修饰的金纳米颗粒通过杂交作用，靠近电极表面，此时是“eT OFF”状态；当检测体系中有Dam甲基化酶和Dpn I限制性内切酶时，DNA双链被甲基化并切断，使得金纳米颗粒远离电极表面，电子可以自由传递，产生可检测的电化学信号（eT ON）。金纳米颗粒自身的空间位阻作用会阻碍电极表面的电子传递，同时，金纳米颗粒上修饰有大量带负电荷的DNA，由于静电斥力，进一步阻碍带负电荷的电活性物质铁氰化钾与电极表面的电子传递，从而实现信号的放大。该方法实现了对Dam甲基化酶的特异性检测，检测限为0.12U/mL，并且能用于对甲基化酶敏感药物的筛选。二、基于甲基化响应的发夹型捕获探针电化学检测DNA甲基化酶活性结合亚甲基蓝标记的报告探针和甲基化响应的发夹型捕获探针，构建了一种灵敏的电化学生物传感器用于检测甲基化酶活性。在该方法中，发夹型捕获探针的茎部包含甲基化酶识别位点。当甲基化酶不存在时，发夹型结构保持完整，捕获探针封闭在其茎部结构中，这阻碍了报告探针与捕获探针之间的杂交，使得标记在报告探针上的电活性物质亚甲基蓝不能靠近电极表面，处于“eT OFF”状态。而当甲基化酶存在时，该位点被甲基化，进而被限制性内切酶切割，使得与报告探针互补的捕获链暴露出来，通过DNA链之间的互补配对，报告探针上标记的亚甲基蓝靠近电极，从而发生电子传递，产生可测量的电化学信号。以Dam甲基化酶为例，该方法检测限为0.07U/mL，并且可以实现对甲基化酶的动力学研究及相关抑制剂筛选。三、基于发夹型探针和G-四聚体结构免标记电化学检测DNA甲基化酶将电活性物质Hemin可以特异性的与富G序列结合形成具有稳定结构的G-四聚体这一特性，应用于甲基化酶活性的电化学检测。设计了甲基化响应的发夹型探针，其茎部包含甲基化酶的识别位点及一段特异性的富G序列，当甲基化酶不存在时，该序列被封锁在发夹型探针的茎部，不能与Hemin结合，从而没有电化学信号的产生，此时是“eT OFF”的状态；当甲基化酶和限制性内切酶存在时，发夹型探针茎部甲基化酶的识别位点被甲基化并被切割，暴露出能与Hemin结合的富G序列，使得Hemin靠近电极表面，产生可测量的电化学信号。该方法实现了对Dam甲基化酶快速，便捷，高灵敏的电化学检测，检测下限为0.2U/mL。
[Abstract]:DNA methylation plays a very important role in the process of gene expression regulation , genome imprinting , embryo development and normal cell function . 1 . DNA methylase - free electrochemical detection based on gold nanoparticle signal amplification A novel method for detecting Dam methylase activity by using DNA functionalized gold nanoparticles is developed . Firstly , single - stranded DNA is modified on the gold electrode . When there is no Dam methylase , the complementary DNA - modified gold nanoparticles are hybridized to the surface of the electrode , which is the " eT OFF " state . When the detection system has Dam methylase and DpnI restriction enzyme , the DNA double - stranded DNA is methylated and cut off so that the gold nanoparticles are away from the surface of the electrode , electrons can be freely transferred , and the detectable electrochemical signal ( eT ON ) can be generated . A large amount of negatively charged DNA is modified on the gold nanoparticles . Due to the electrostatic repulsive force , the electron transfer between the potassium cyanide and the electrode surface of the negatively charged electroactive material is further hindered , thereby realizing amplification of the signal . 2 . Detection of DNA methylase activity electrochemically by hairpin - type capture probe based on methylation response A sensitive electrochemical biosensor for detecting methylase activity is constructed in combination with methylene blue - labeled reporter probes and methylation - responsive hairpin - type capture probes . In this method , the hairpin - type capture probes contain methylase recognition sites . III . DNA methylase - free electrochemical detection based on hairpin - type probes and G - tetrameric structures A hairpin - type probe with stable structure is formed by binding an electroactive substance Hemin with a rich G sequence to form a G - tetramers with stable structure . The hairpin - type probe is designed with methylation response , and the stem part of the hairpin - type probe is blocked on the stem part of the hairpin type probe when the methylase does not exist ;

【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R341

【参考文献】