人骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的量效关系研究

发布时间：2018-02-27 11:29

  本文关键词： 骨髓间充质干细胞 成骨诱导 组织工程 构建　出处：《北京协和医学院》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： 骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是组织工程骨目前最常用的种子细胞,BMSCs构建组织工程骨(tissue engineering bone,TEB)的量效关系是TEB临床应用中的重要问题,但是目前尚未见明确报道。本实验研究了hBMSCs体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达和体外传代对hBMSCs干细胞表面标志表达、增殖和分化能力的影响,并通过不同浓度hBMSCs构建TEB的体外观察及不同数量hBMSCs构建TEB的体内异位成骨研究,对hBMSCs构建TEB的量效关系进行了初步探讨。 方法： 1、密度梯度离心法分离hBMSCs,应用流式细胞检测、成骨及成脂诱导分化进行干细胞鉴定。 2、对hBMSCs进行体外成骨诱导分化,应用RT-PCR法对体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。 3、对hBMSCs进行体外传代扩增培养,应用流式细胞技术、MTT法和细胞计数法检测不同代数hBMSCs的干细胞表面标志和增殖能力；应用Real-time PCR法和油红0染色检测不同代数hBMSCs的成骨和成脂分化能力。 4、使用不同浓度hBMSCs接种β-TCP支架,应用扫描电镜(SEM)、组织学染色(HE)和Real-time PCR法检测不同浓度hBMSCs在β-TCP支架上的生长和成骨分化情况。 5、使用相同浓度不同体积hBMSCs接种β-TCP支架构建组TEB并植入裸鼠皮下,应用组织学检测其体内异位成骨情况。 结果： 1、hBMSCs的生物学特性：密度梯度离心、贴壁筛选结合消化控制法分离得到的hBMSCs表达干细胞表面标志：CD90、CD29、CD166、CD44、CD73、CD1O5,在体外可分化为成骨细胞和脂肪细胞。 2、hBMSCs体外成骨诱导：成骨相关基因在诱导早期部分表达,中期均有表达,基因表达大部分在14天达高峰,与矿化相关的基因表达在21天达高峰。 3、hBMSCs体外传代培养：P4代以后的hBMSCs的增殖能力、成脂和成脂分化能力减弱。 4、hBMSCs构建TEB的体外研究：高浓度组(10×106和20×106cell/ml) hBMSCs在β-TCP支架的生长和基质分泌情况优于低浓度组(1×106和5×106cell/ml)。不同浓度组的成骨分化水平无明显差异。 5、hBMSCs构建的TEB的体内研究：相同浓度的hBMSCs接种β-TCP支架构建的TEB,接种体积增加,体内成骨成功率增加。 结论： 密度梯度离心、贴壁筛选结合消化控制法可成功分离hBMSCs。hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达,其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似;Passage 5 (P5)代之前的hBMSCs增殖和分化能力较强,适宜临床选用；10×106和20×106cell/ml是hBMSCs接种β-TCP支架的适宜浓度；TEB体内成骨成功率随hBMSCs的接种数量增加而增加。hBMSCs构建组织工程骨的量效参数能够为组织工程骨的进一步研究及临床应用提供参考。
[Abstract]:Objective:
Bone marrow mesenchymal stem cells (human bone mesenchymal stem cells, BMSCs) is the most commonly used bone tissue engineering seed cells to construct tissue engineering bone BMSCs (tissue engineering bone, TEB) of the dose-response relationship is an important issue in the clinical application of TEB, but has not been reported at present. The experimental study of hBMSCs in vitro osteogenic induction at different time points into passages on hBMSCs expression of stem cell surface markers of bone related gene expression and body, influence the proliferation and differentiation ability, and by different concentrations of hBMSCs in vitro and in vivo ectopic construction of different numbers of hBMSCs TEB to construct TEB osteogenesis, the dose effect relation of the construction of TEB hBMSCs a preliminary study.
Method锛，

本文编号：1542479