NO对神经胶质细胞迁移及netrin-1表达影响的研究

发布时间：2018-03-03 05:18

本文选题：神经胶质细胞　切入点：netrin-1　出处：《苏州大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：星形胶质细胞和小胶质细胞是中枢神经系统的重要组分，它们通过迁移等参与构建和修复神经网络复杂的结构。细胞迁移受细胞内外多种因素的调节，包括信号传导、细胞骨架及参与粘着斑形成的各种分子等。在神经发生、神经再生、损伤修复、免疫、感染和癌症转移等多种生理病理过程中发挥重要作用。Netrins是神经导向因子家族成员，哺乳动物中已经鉴定出来的netrins分子包括三种分泌型（netrin-1、3、4）和两种跨模型（netrin-G1、G2）。其中，netrin-1是高度保守的成员，与不同的受体结合对细胞迁移起着吸引或排斥的作用，引导轴突靶向生长。在神经损伤和炎症的病理过程中，NO在炎症反应的发生和信号传导方面起到关键的调节作用；NO在中枢神经系统可作为神经递质，调节突触可塑性，参与长时程增强效应。那么，netrin-1对细胞迁移的影响是否是通过NO调节而实现的？本文探讨NO对星形胶质细胞和小胶质细胞的迁移和netrin-1及其受体DCC、UNC5B表达的影响，为进一步探寻神经胶质细胞的迁移机制以及神经损伤与炎症治疗提供新思路。目的：观察NO对星形胶质细胞和小胶质细胞迁移的影响，检测NO对神经胶质细胞netrin-1及其受体DCC、UNC5B表达的影响，探讨神经胶质细胞的迁移机制以及NO和netrin-1在早期的神经损伤修复中的作用。方法：(1)取新生1天的SD大鼠大脑皮质，进行混合胶质细胞原代培养，根据各种细胞黏附能力和生长时间的差异，通过机械振荡法和差速贴壁法分离纯化星形胶质细胞和小胶质细胞。(2)通过MTT法确定NO供体硝普钠（SNP)最佳给药浓度。建立星形胶质细胞和小胶细胞的划痕模型，设置对照组和实验组，，对照组不作处理，实验组2%的培养基中加入终浓度为50μmol/L的SNP，分别于不同时间点观察细胞迁移情况。(3)SNP处理后，分别于不同时间点（0h、6h、12h、24h、48h、72h）收集细胞及其培养上清，用NO测定试剂盒检测培养上清中亚硝酸盐类的浓度，判断NO是否主要由外源供体SNP供给。采用western blotting和免疫细胞化学方法检测netrin-1蛋白的表达变化。(4)设置对照组、SNP+Hb组和SNP组，相应处理24h，采用real timePCR检测各组细胞中netrin-1及其受体DCC和UNC5B的mRNA表达变化。结果：(1)采用振荡培养法和差速贴壁法培养出星形胶质细胞和小胶质细胞，纯度在95%以上。(2)通过MTT结果确定实验中NO供体硝普钠合适浓度为50μmol/L。划痕模型结果发现，加入SNP的实验组中星形胶质细胞和小胶质细胞迁移速度明显快于对照组，且小胶质细胞的迁移速度相对快于星形胶质细胞。NO检测试剂盒测定不同时间点的细胞培养上清，与对照组相比，实验组中NO2浓度随着时间的推移明显增加，说明实验组中NO主要是由外源供体硝普钠供给。(3)免疫细胞化学和westernblotting结果都显示对照组netrin-1表达较少，而实验组随着时间的推移表达显著增加（P0.01），星形胶质细胞netrin-1表达在48h达到最高，小胶质细胞netrin-1则在24h达到最高。表明NO浓度较高时能上调netrin-1表达。（4）SNP+Hb组与对照组相比，netrin-1、DCC、UNC5B的mRNA表达无明显变化，而SNP组与对照组相比，各基因的表达都明显上调，且受体DCC比UNC5B上调更为明显（P0.01）。结论：NO能促进星形胶质细胞和小胶质细胞的迁移，netrin-1及其受体DCC、UNC5B表达水平升高，表明netrin-1促进星形胶质细胞和小胶质细胞的迁移可能是由NO调控的。推测NO及netrin-1在神经损伤修复中发挥了一定的作用。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】