CTGF在人胚胎干细胞增殖及其向定型内胚层细胞分化中的作用研究

发布时间：2018-03-04 15:25

  本文选题：hESCs　切入点：定型内胚层　出处：《广西医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： 研究结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)在人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells, hESCs)增殖及其向定型内胚层(Definitive endoderm, DE)细胞分化中所发挥的作用及其调控机制。 方法： 首先以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)为饲养层细胞,在体外条件下培养hESCs,并将hESCs转移至无饲养层体系下继续培养。通过免疫荧光和碱性磷酸酶染色的方法对所培养hESCs的Oct4、Nanog及碱性磷酸酶等干性标志性基因的表达水平进行检测,从而证明所培养细胞的分化全能性。在此基础上,利用ActivinA与Wnt3a的因子组合诱导hESCs向DE细胞分化,并通过流式细胞术对分化的效率进行检测。 在以上的工作基础上,我们展开了CTGF对人胚胎干细胞增殖与分化作用的研究。一方面我们通过碱性磷酸酶染色的方法考察CTGF对hESCc增殖的影响；另一方面,通过流式细胞术分析CTGF在hESCs向DE细胞分化中的作用。 为进一步研究CTGF在hESCs增殖与分化中的作用机制,我们通过Western Blot险测了在hESCs中CTGF对MAPK信号通路和TGF-β信号通路中相关蛋白磷酸化的影响。从而初步确定了在hESCs中与CTGF调控相关的信号通路。 接下来结合我们实验室前期工作中的miRNA芯片筛选结果,对在hESCs分化前后差异表达倍数比较高、且都以CTGF为共同靶基因的几个miRNA对CTGF表达的调控作用进行了研究。通过实时定量PCR和Western Blot对这几个miRNA调控CTGF表达的效果进行了检测,结果表明miR-375对CTGF的调控作用最为明显。接下来利用生物信息学分析软件TargetScan和PicTar等对CTGF的基因序列进行了分析,预测了miR-375与CTGF之间的结合位点,并进一步通过Luciferase对其结合关系进行了验证。最后通过碱性磷酸酶染色的方法研究了在hESCs中过表达miR-375对hESCs增殖的影响。 结果： 免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色结果显示,体外培养的hESCs其Oct4、 Nanog及碱性磷酸酶均高水平表达,说明hESCs具有良好的分化潜能。诱导hESCs向DE细胞分化后,细胞中Sox17的表达水平比较高,流式细胞术结果显示CXCR4阳性细胞在50%以上,说明我们成功建立了hESCs向DE细胞分化的模型。 对CTGF在hESCs增殖及其向DE细胞分化中所发挥作用的研究中,Western Blot的结果显示在hESCs向DE细胞分化的过程中CTGF的表达明显下调。此外我们还发现CTGF对hESCc的增殖具有一定的促进作用,对其向DE细胞的分化具有抑制作用。 在对CTGF调控相关的信号通路的研究中发现,在hESCs中CTGF对MAPK信号通路和TGF-β信号通路均具有促进作用。 在miRNA对CTGF表达的调控作用研究中,我们发现miR-375对CTGF的调控效果最为明显。uciferase的结果进一步表明,miR-375通过与CTGF的3’UTR区域结合而发挥调控CTGF表达的作用。此外我们还发现过表达miR-375可以抑制hESCs的增殖。 结论： 1、CTGF对于hESCs的增殖具有明显的促进作用,对hESCs向DE细胞的分化具有抑制作用。 2、在hESCs中CTGF对人胚胎干细胞增殖与分化的调控作用可能与MAPK信号通路和TGF-β信号通路有关。 3、miR-375通过与CTGF3'UTR区域结合而调控CTGF的表达。 意义： 在人体内,由于肝脏细胞以及胰腺细胞等功能性细胞均由内胚层细胞发育而来,因此诱导hESCs向DE细胞分化是最终得到成熟、有功能的肝脏及胰腺细胞的前提,是最终实现人体组织修复和器官再生的基础,也是根治重症肝病和糖尿病的希望所在。因此研究hESCs维持及其向DE细胞分化的分子机制具有非常重要的意义。本课题所开展的CTGF在hESCs增殖及其向DE细胞分化的作用研究,是hESCs维持及分化机制研究的一部分,对于人们认识hESCs向成熟细胞定向分化的机制具有重要意义,对于疾病的治疗也具有潜在的应用价值。
[Abstract]:Objective:
Objective to study the role of Connective tissue growth factor (CTGF) in the proliferation of human embryonic stem cells (Human embryonic stem cells, hESCs) and its role in the differentiation of stereotypic endoderm (Definitive, cells) cells and its regulatory mechanism.
Method锛，

本文编号：1566235