兔气管黏膜上皮细胞和骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定

发布时间：2018-03-04 22:00

  本文选题：气管黏膜上皮细胞　切入点：骨髓间充质干细胞　出处：《扬州大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： 探讨兔气管黏膜上皮细胞和骨髓间充质干细胞的体外培养技术和鉴定方法。 一、建立气管黏膜上皮细胞体外培养模型,探讨其体外生长与传代的规律。 二、体外构建气管黏膜上皮细胞片。 三、体外分离培养骨髓间充质干细胞,并对其进行鉴定,为进一步研究骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化提供实验方法和技术支持。 方法： 一、体外培养气管黏膜上皮细胞 (1)通过组织块法、两步酶消化法获得兔气管黏膜上皮细胞并传代培养。 (2)将第3代两种方法培养的上皮细胞及冻存复苏后的上皮细胞分别种植于96孔板内,于6、12、24、36、48、60、72小时取出,用MTT法测定细胞增殖活性。 (3)通过HE染色、扫描电子显微镜分别对培养的上皮细胞的形态结构进行观察,通过免疫细胞化学、免疫荧光分别对获得的上皮细胞实施PCK、CK-18检测,进行鉴定。 二、体外构建气管黏膜上皮细胞片 采用组织块法培养的上皮细胞作为种子细胞,利用温敏培养皿制作上皮细胞片,并通过HE染色、免疫细胞化学、免疫荧光染色、扫描电子显微镜对细胞片进行鉴定。 三、体外分离培养骨髓间充质干细胞 通过细胞密度梯度离心法、全血培养法获得骨髓间充质干细胞并传代培养,采用流式细胞术进行骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定。 结果： 一、体外培养气管黏膜上皮细胞 (1)通过组织块法、两步酶消化法可以获得兔气管黏膜上皮细胞,组织块法对细胞伤害较小,杂化细胞较多,但可以通过细胞纯化处理获得较高纯度的上皮细胞。机械刮除法等细胞纯化方法有助于上皮细胞的进一步纯化。 (2)冻存三个月的细胞,复苏后存活率、贴壁率较高,但生长增殖速度明显不如未冻存细胞。 (3)HE染色可见细胞形态呈梭形、圆形、多角形等,细胞核深染,细胞质呈淡红色。 (4) SABC法染色检测细胞中的角蛋白及上皮细胞特异性角蛋白,细胞核呈淡蓝色,细胞质呈棕黄色；而对照组中细胞核呈淡蓝色,细胞质未见棕黄色,结果表明分离培养的细胞为上皮细胞。 (5) FITC标记的荧光抗体检测细胞中的角蛋白及上皮细胞特异性角蛋白,可见细胞及细胞核形态,同时细胞质呈亮绿色；而对照组中可见细胞及细胞核形态,但细胞质未见亮绿色,结果表明分离培养的细胞为上皮细胞。 (6)扫描电子显微镜检测中明显可见部分细胞有纤毛,表明分离培养的细胞为上皮细胞。 二、上皮细胞片的制作 (1)采用组织块法培养的上皮细胞作为种子细胞,种植到温敏培养皿上。约10-14天,细胞基本长满皿底。换液后隔天可以收获细胞片。 (2)HE染色可见细胞片中细胞密集排列,细胞核深染,细胞质呈淡红色。 (3) SABC法染色检测细胞片中的角蛋白及上皮细胞特异性角蛋白,细胞排列紧密,细胞核淡蓝色,细胞质棕黄色,而对照组中细胞密集排列,细胞核深染,细胞质未见棕黄色,结果表明利用纯化后的上皮细胞制作的细胞片为上皮细胞片。 (4) FITC标记的荧光抗体检测细胞片中的角蛋白及上皮细胞特异性角蛋白,细胞排列密集,可见细胞及细胞核形态,细胞质呈亮绿色,而对照组中细胞密集排列,细胞及细胞核形态可见,但细胞质未呈亮绿色,结果表明构建的细胞片为上皮细胞片。 (5)扫描电子显微镜检测中可见细胞密集排列,部分细胞中可见纤毛,结果表明构建的细胞片为上皮细胞片。 三、骨髓间充质干细胞的培养 (1)全血培养法和细胞密度梯度离心法均可以获得骨髓间充质干细胞。细胞呈梭形、圆形、不规则形等。 (2)采用流式细胞检测技术,鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原,CD29、CD44高表达,不表达CD14、CD34。 结论： 1、应用组织块法和消化法成功构建了气管黏膜上皮细胞的原代培养模型。 2、利用温敏培养皿在体外成功构建了气管黏膜上皮细胞片。 3、体外成功分离、培养出兔骨髓间充质干细胞,并进行细胞表面抗原鉴定,为进一步研究人骨髓间充质干细胞及干细胞向上皮细胞诱导分化提供理论基础与技术支持。
[Abstract]:Objective:
The culture techniques and identification methods of rabbit tracheal epithelial cells and bone marrow mesenchymal stem cells were studied in vitro.
First, the culture model of tracheal epithelial cells in vitro was established, and the laws of its growth and passage in vitro were discussed.
Two, the epithelial cells of the tracheal mucosa were constructed in vitro.
Three, in vitro culture and identification of bone marrow mesenchymal stem cells, and provide experimental methods and technical support for further research on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into epithelial cells.
Method锛，

本文编号：1567468