罗非鱼T淋巴细胞几种标志基因的克隆及表达研究

发布时间：2018-03-07 01:17

本文选题：罗非鱼　切入点：T淋巴细胞　出处：《西南大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：T淋巴细胞可介导机体的特异性细胞免疫应答,在机体的免疫应答与免疫调节中具有重要地位与作用。硬骨鱼类是同时拥有非特异性免疫应答与特异性免疫应答的最原始脊椎动物。硬骨鱼类免疫相关研究不仅有助于从分子进化角度深化对免疫分子的认识与理解,而且在鱼类病害防治方面具有重要意义。目前,已有大量研究相继从不同种类硬骨鱼类分离、鉴定免疫细胞相关分子,极大推进了鱼类分子免疫的相关研究；但是,一直以来,硬骨鱼类由于缺乏淋巴细胞特异分子标志的检测抗体,因此,对T淋巴细胞及其亚群的分化发育、功能、调控机制等方面的认识仍处于起步阶段。罗非鱼作为世界性的养殖性鱼类,目前尚未见对其T淋巴细胞分子标记的克隆及鉴定等方面的相关报道。鉴于此,本研究以罗非鱼(在本研究中,如未特殊说明,用于实验研究的罗非鱼均指尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus))为实验对象,一方面克隆T淋巴细胞特异分化抗原CD33γ/δ、CD4、CD8αcDNA序列,并对其组织表达模式进行初步研究：另一方面,分别构建罗非鱼CD3γ/δ、CD4、CD8α、Foxp3部分区段的原核表达载体,并对其原核表达条件进行初步探索。主要研究结果如下： 1.通过生物信息学分析与RT-PCR方法相结合,从罗非鱼克隆T淋巴细胞的几种标志基因CD3y/δ、CD4和CD8a的cDNA序列,结果显示： 1)罗非鱼CD3y/δ由6个外显子组成,cDNA长620 bp,其中5’端UTR86 bp,3’端UTR 18 bp,ORF 516 bp,编码171个氨基酸,其中包括信号肽27个氨基酸、胞外区68个氨基酸、跨膜区23个氨基酸与胞内区53个氨基酸；系统进化分析显示,罗非鱼CD3γ/δ与哺乳动物的CD3γ、CD3δ、CD3ε各自聚为不同的枝,而与鳜鱼(Siniperca chuatsi)、大西洋鲑(Salmo salar)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、河豚(Takifugu rubripes)、东方渶(Tetraodon nigroviridis)等在内的硬骨鱼类CD3γ/δ同聚为一枝,其氨基酸序列的相似度分别为56.4%、44.4%、43.6%、52.5%、51.2%,从而表明,在硬骨鱼类分化前,CD3γ/δ已与CD3γ、CD3δ、CD3ε基因发生分离；结构序列进一步分析显示,罗非鱼CD3γ/δ具有其他物种CD3的共有特征性基序,即胞外区的2个半胱氨酸残基、CxxCxE基序及胞浆区的一个免疫受体活化基序ITAM。 2)罗非鱼CD4由9个外显子组成,cDNA长3259 bp,其中5’端UTR 141bp,3’端UTR 1714 bp, ORF 1404 bp,编码467个氨基酸,其中包括信号肽20个氨基酸、胞外区394个氨基酸、跨膜区23个氨基酸、胞内区30个氨基酸；系统进化分析显示,罗非鱼CD4与其他物种CD4-like各聚为不同的枝,说明其分化时间早,与河豚、东方渶、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、斑点叉尾洶(Ictalurus punctatus)、斑马鱼(Danio rerio)等在内的硬骨鱼类CD4同聚为一枝,其氨基酸序列的相似度分别为45.8%、46%、37.6%、34.5%、29.3%；结构序列进一步分析发现,罗非鱼CD4分子胞外区具有4个免疫球蛋白样结构域,存在多个保守性位点,包括WTC基序和N-糖基化位点,其胞浆区也有一个保守的CxC基序。 3)罗非鱼CD8α由5个外显子组成,cDNA长1050 bp,其中包括5’端UTR 424 bp和ORF部分序列626 bp,编码208个氨基酸,其中包括信号肽21个氨基酸、胞外区151个氨基酸、跨膜区23个氨基酸、胞内区13个氨基酸。系统进化分析显示,罗非鱼CD8α与其他物种CD8β各聚为一枝,说明其分化时间早,与河豚、大西洋鲑、斑点叉尾洶、斑马鱼、鲤鱼(Cyprinus carpio)等在内的硬骨鱼类CD8α聚为一枝,其氨基酸序列的相似度分别为51.7%、41.8%、34.6%、32.3%、35.9%。结构序列进一步分析发现,在已知物种的CD8分子中,参与V结构域链内二硫键形成的两个半胱氨酸基序非常保守,而p56lck结合基序CxC及与β2m、MHCⅠ类分子相互作用的残基如精氨酸、赖氨酸和亮氨酸等不保守。 2. RT-PCR检测CD3γ/δ、CD4与CD8α在各组织的表达模式,结果显示,CD3γ/δ、CD4与CD8α在多种组织均有表达,但在免疫相关组织如鳃、脾、肾脏、头肾、肠中表达量明显高于非免疫相关组织。 3.经生物信息学系统分析,结合融合蛋白原核表达策略,分别构建了罗非鱼T淋巴细胞表面特异分化抗原CD3γ/δ、CD4与CD8α的胞外区段及Foxp3非保守区段的原核表达载体(包括pColdⅠ和pET-28a),在不同条件下经IPTG诱导表达,结果显示： 1) CD3γ/δ-pET-28a型重组质粒在不同温度(20℃、30℃、37℃)下均有目的蛋白的可溶性表达,在37℃条件下表达量最高； 2) Foxp3-F1R2-pET-28a型重组质粒在30℃、37℃有明显目的蛋白的包涵体表达,两种温度条件下其表达量无明显差异； 3) CD4-pColdⅠ、CD4-pET-28a、CD8-pET-28a型重组质粒在不同温度下均未检测到目的蛋白的表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.1

【参考文献】