稳定表达软骨调节素Ⅰ的大鼠MSCs细胞株的建立
本文选题：软骨调节素-Ⅰ 切入点：MSCs 出处：《大连医科大学》2011年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的:构建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ表达载体,稳定转染大鼠骨髓间充质干细胞,并验证其在MSCs中的上调表达,建立ChM-Ⅰ稳定上调表达的MSCs细胞株,为进一步开展ChM-Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化,构建组织工程软骨相关研究打下基础。 方法: 1.用Trizol法提取大鼠软骨组织总RNA,根据ChM-Ⅰ基因序列(序列号:AF051425)设计特异引物,上游引物为:5' GCAGACAAGCTTATGACAGAGAACTCGGACA 3' ,下游引物为:5' GCAGACGCGGCCGCTTACACCATGCCCAAGATG 3',通过PCR获取ChM-Ⅰ目的基因,分别将ChM-Ⅰ目的基因的PCR产物和pcDNA3.1 (+)质粒双酶切,并将两者定向连接,构建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒,转化感受态细菌,挑取阳性单克隆并扩增,酶切鉴定阳性克隆,并对插入的ChM-Ⅰ片段进行测序。 2.密度梯度离心法获得大鼠MSCs,传代培养并扩增。使用流式细胞技术检测细胞表面抗原;对大鼠MSCs进行成脂及成骨诱导培养,检测所获得MSCs的潜在分化能力。 3.脂质体法将质粒转染进大鼠MSCs。实验分三组:实验组(转染pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒);对照组(转染pcDNA3.1(+)质粒);空白组。通过预实验,确定大鼠MSCs的最佳G418筛选浓度为200ug/ml。转染复合体作用6小时后,更换完全培养基,48小时后加入200ug/mlG418筛选培养基,使用筛选培养基持续传代培养并扩增实验组和对照组细胞,以获得稳定转染质粒的大鼠MSCs。 4.取稳转后连续培养三代的大鼠MSCs提取总RNA和蛋白质,使用RT-PCR和Western blot分别在RNA和蛋白质水平上检测ChM-Ⅰ在各组大鼠MSCs细胞株内的转录和表达,鉴定所筛选的大鼠MSCs细胞株中ChM-Ⅰ的上调表达及其稳定性。 结果: 1.对阳性克隆鉴定及测序和序列分析对比,结果显示与ChM-Ⅰ基因长度相符,序列无误,且读码框正确。 2.单细胞悬液接种48小时后换液,倒置显微镜观察并拍照,可于培养皿底部见到呈梭形或三角形的贴壁细胞,培养11-13天后培养皿底部细胞密度达到90%以上。细胞传代,在6小时内可达80%以上贴壁,细胞生长速度加快,可见细胞呈成纤维细胞样生长,折光性较强,可呈鱼群样生长。流式细胞仪鉴定结果:MSCs阳性表面抗原CD90、CD29的表达率分别为99.79%、98.41%;MSCs阴性表面抗原CD45、CD11b/c的表达率分别为2.77%、2.51%。成脂诱导2周后,油红O染色,脂滴为橙红色;成骨诱导3周后,茜素红染色,镜下显现为红色斑片。 3.转染复合体作用6小时后,可见大量MSCs胞质内出现折光性强的小泡,提示阳离子脂质体已结合质粒进入MSCs。48小时后加入200ug/mlG418筛选培养基5天后空白组出现少量细胞漂浮死亡,实验组和对照组也可见少量细胞死亡。7天后空白组出现大量死亡,14天后空白组细胞全部死亡,两个转染组大约有10%的细胞存活,转染组细胞不再死亡,开始增殖,生长速度逐渐加快。传代后,细胞生长旺盛,排列密集整齐,呈编织状旋涡状。 4. RT-PCR结果:采用ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值作为评定指标,实验组、对照组和空白组ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分别为1.0817±0.2233、0.3601±0.1260、0.3687±0.0086;实验组与对照组和空白组间具有统计学意义P0.05,对照组与空白组间无统计学意义P 0.05。Western blot结果:采用ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值作为评定指标,实验组、对照组和空白组ChM-Ⅰ/GAPDH灰度比值的平均值分别为0.9867±0.0204、0.4155±0.0206、0.3751±0.0081;实验组与对照组和空白组间具有统计学意义(P0.05),对照组与空白组间无统计学意义(P 0.05)。结果提示:实验组中的ChM-Ⅰ在mRNA水平和蛋白水平上的表达均明显高于对照组和空白组。 结论: 成功将pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒转染到大鼠骨髓间充质干细胞中,经过含G418的筛选培养基稳定筛选,最终建立ChM-Ⅰ稳定上调表达的MSCs细胞株,为进一步开展ChM-Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化,构建组织工程软骨相关研究打下基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329
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