GAS下调巨噬细胞炎症因子的作用及机制研究

发布时间：2018-03-09 15:39

本文选题：巨噬细胞　切入点：A族链球菌　出处：《河北医科大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:A族链球菌(GAS,又称为化脓性链球菌)可以引起多种人类疾病,最常见的GAS感染是上呼吸道感染,引发咽炎。尽管咽部感染是自限性的,但如果未彻底治愈,可能发生急性肾小球肾炎、急性风湿热、风湿性心脏病等感染后遗症;有时,GAS感染还会引起严重的侵袭性疾病,如链球菌毒性休克综合症,坏死性筋膜炎等。GAS感染的结果及其严重程度可能依赖于宿主固有免疫机制控制细菌的生长和限制感染部位的病原体进一步扩散的能力。巨噬细胞是启动固有免疫应答的主要力量,并启动稍后的适应性免疫应答。而且,宿主对GAS反应的有关资料也显示在鼠感染模型中定居巨噬细胞在控制GAS感染中发挥着关键作用。巨噬细胞能够识别、吞噬和破坏GAS以清除入侵的病原体,而其产生的细胞因子,趋化因子对于控制感染部位的炎症细胞的招募和活化至关重要。因此,在GAS感染期间巨噬细胞的功能性活化可能大大影响了致病过程的特征、进程和转归。但是,GAS同时也进化出多种策略以克服宿主的免疫反应。资料显示,一个常见的现象是在严重坏死的GAS感染部位的一线防御细胞数量极少。而且,在体内的感染模型中,GAS的M蛋白是已知的诱导炎症的主要力量,当其及其它毒力因子被单核细胞表面的PRR识别后可以触发多种细胞因子的分泌,包括IL-6,IL-1β,TNF-α,TGF-β等。值得一提的是,产生的细胞因子不但可以诱导炎症可能还会影响链球菌的侵袭等机制。例如,GAS介导产生的TGF-β被发现可以上调整合素α5的表达,即,GAS通过操控宿主细胞因子的产生,提高靶受体的表达水平,进而促进其与宿主细胞的粘附和内化。除此之外,GAS诱导产生的细胞因子还可以通过结合细胞表面的死亡受体诱导巨噬细胞凋亡。这种诱导细胞死亡或凋亡的能力可能对细菌有利,使其逃避吞噬活性或损伤宿主组织,进而促进其向更深部位浸润和播散。本研究旨在进一步了解有利于GAS适应生存和持续感染状态下的巨噬细胞对GAS的复杂反应,及GAS逃避巨噬细胞攻击的策略,从而进一步探索GAS的致病机制,因此,拟采取以下实验:1、蛋白芯片检测巨噬细胞受GAS感染后其产生的细胞因子的表达谱,利用Real-time PCR验证并动态分析细胞因子的表达,以大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(SA)分别作为G-和G+菌感染巨噬细胞之对照。2、以炎症网络的调节者IL-6为靶点,行In-cell western、ELISA、western blot以了解IL-6的动态变化及其特异性核转录因子亚基C/EBPβ的活化。3、流式细胞术、Real-time PCR、Western blot检测细菌作用下巨噬细胞的TLRs、MyD88、NF-κB,初步了解细菌作用下巨噬细胞活化信号转导通路。4、动物实验验证体内是否与体外细胞水平结果一致。以期为研究GAS的致病机制和免疫治疗提供新视角。方法: 1蛋白芯片分别检测鼠腹腔巨噬细胞和鼠巨噬细胞RAW264.7受到GAS感染后三天炎症相关因子及趋化因子的表达谱,同时以E.coli和SA分别作为G-和G+菌感染巨噬细胞之对照。 2 Real-time PCR验证GAS/SA/E.coli刺激巨噬细胞后产生的炎症相关因子(如IL-6,IL-1β,TNF-α)和趋化因子(如MCP-1,Rantes,GRO-α)的动态变化。 3 ELISA、in-cell Western检测RAW264.7细胞受到GAS/SA/E.coli感染后产生的主要促炎症因子IL-6的动态变化。 4 RAW264.7细胞、BLAB/c小鼠分别接受GAS/SA/E.coli刺激后三天,流式细胞术分析RAW264. 7细胞和鼠腹腔巨噬细胞膜表面TLR的表达。 5 Real-time PCR检测鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞受到GAS/SA/E.coli刺激后TLR胞内段接头蛋白MyD88的表达差异。 6 Western blot检测RAW264.7细胞受到GAS/SA/E.coli刺激后核转录因子C/EBPβ的表达差异。结果: 1蛋白芯片结果显示,RAW264.7细胞受到GAS/SA/E.coli感染后3天表达的炎症相关分子中与正常比较表达差异最大的为TNF-α(Ratio:6.07);BLC(Ratio:4.2),IL-1α(Ratio:2.85),Rantes(Ratio:2.68),MCP-1(2.17),LIX (Ratio:1.98),G-CSF(Ratio:1.88),IL-6(Ratio:1.71),M-CSF(Ratio:1.59),及IL-1β(Ratio:1.55)的表达量依次次之。鼠腹腔巨噬细胞受到GAS/SA/E.coli感染后3天的蛋白芯片结果显示与正常比较表达差异最大的为BLC(Ratio:5.0)的表达量最高,KC(Ratio:4.49),IL-1α(Ratio:4.3),TNF-α(2.49),LIX(Ratio:2.25),M-CSF(1.93),IL-1β(1.69),IL-6(1.5)的表达量依次次之; 2 RAW264.7细胞受GAS/SA/E.coli刺激后产生的细胞因子的动态分析显示在2小时之内高表达的主要细胞因子为GRO-α,IL-1β及TNF-α。在2小时候后高表达的主要细胞因子为IL-1β,IL-6,IL-12,MCP-1及IL-10;在对鼠腹腔巨噬细胞受GAS/SA/E.coli刺激后的细胞因子的动态分析显示在2小时内高表达的主要细胞因子为GRO-α,IL-23,TNF-α,Rantes。在2小时后高表达的主要细胞因子为GRO-α,IL-1β,IL-12,MCP-1,MIP-1α。 3无论是鼠腹腔巨噬细胞还是RAW264.7细胞受到GAS刺激后所分泌的细胞因子水平绝大部分较SA和E.coli刺激组低,除了抑制因子IL-10和TGF-β外;其中,在RAW264.7细胞中,IL-10的水平远远高于SA刺激组和E.coli刺激组。而在鼠巨噬细胞中,抑制因子TGF-β的水平占了优势,尽管SA刺激组也表达了高水平的TGF-β。从细胞因子分泌动态角度,无论是鼠腹腔巨噬细胞还是RAW264.7细胞在受到E.coli刺激后产生的细胞因子大多数在1天内达到最高水平;而该细胞受GAS和SA刺激后产生的细胞因子大多数在1天后达到最高水平。 4 TLR受体的表达: 流式细胞术结果及实时定量PCR结果均显示:TLR2:在GAS刺激组和SA刺激组的无论是鼠腹腔巨噬细胞还是RAW264.7细胞表面的TLR2的水平均高于PBS组,且差异具有显著性,而尽管E.coli组的TLR2的水平略高于PBS组,但二者没有显著差异。TLR4:RAW264.7细胞及鼠腹腔巨噬细胞在受到GAS/SA/E.coli刺激后,TLR4的水平均高于PBS组,三组之间无显著差异。 5膜受体接头蛋白MyD88的水平:在感染的2小时内,在鼠腹腔巨噬细胞实验中三组的MyD88的水平均高于PBS组,三组间无显著差异;尽管细菌作用的三组RAW264.7细胞与正常对照组无显著差异。 6核转录因子在细菌作用下的状况: NF-kB:RAW264.7细胞受GAS刺激后,核内的NF-kBp65逐渐增多,而SA刺激该细胞后核内的NF-kBp65始终都处于高水平,但E.coli刺激该细胞后核内的NF-kBp65的水平最低,且逐渐减少。EMSA检测结果显示:GAS刺激组的RAW264.7细胞核内的NF-kB主要在刺激1d后达到高水平状态,而SA刺激后的2h~1d的时段核内的NF-kB都处于高水平状态,尤其是6小时时最明显。E.coli刺激后的RAW264.7细胞核内的NF-kBp65的水平最低,仅在刺激后的2h~6h时检测到少量NF-kB,这与上述的Western blot结果一致。 C/EBPβ:RAW264.7接受菌刺激后,Western blot结果显示G+菌GAS、SA的信号强度高于E.coli及正常对照,这与上述各种方法检测所得G+(包括GAS、SA)诱导该细胞产生较高水平IL-6结果一致。结论: 1 GAS/SA/E.coli分别诱导RAW264.7细胞和鼠腹腔巨噬细胞产生了不同程度的炎症因子反应。在感染初期巨噬细胞以分泌募集、活化中性粒细胞、诱导产生急性期蛋白为主的炎症因子GRO-α,IL-1β及TNF-α等;在感染三天后以分泌募集、活化巨噬细胞、诱导并维持炎症为主的炎症因子IL-1β,IL-6,IL-12,MCP-1等。 2 GAS在体内外均诱导鼠巨噬细胞产生迟缓而微弱的炎症因子反应;SA诱导RAW264.7细胞产生滞后而强烈的炎症因子反应,但却在体内诱导了一个滞后而较强的炎症因子反应;E.coli无论是在体内还是在体外均诱导鼠巨噬细胞产生迅速而强烈的炎症因子反应,尤其是体内感染时。 3 GAS/SA/E.coli诱导巨噬细胞产生的炎症因子差异与TLR或TLR4的识别有关;E.coli主要诱导TLR4高表达,GAS与SA均可同时诱导TLR2和TLR4的高表达,这可能有利于其与TLR2或TLR4的结合。 4接头蛋白MyD88参与了病原体感染的巨噬细胞的的信号转导过程,但与GAS/SA/E.coli诱导巨噬细胞炎症因子反应的快慢、强弱没有必然联系。可能还存在其他接头蛋白参与调节巨噬细胞反应的信号转导,导致NF-kB转位入核的时间和数量存在差异,这可能是GAS/SA诱导了不同的巨噬细胞反应的原因,而E.coli诱导巨噬细胞产生MIP-1β及TNF-α等为主的炎症因子并不主要依赖核转录因子NF-κB及C/EBPβ的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

【共引文献】