毛囊干细胞和表皮干细胞生物学特性的比较研究

发布时间：2018-03-10 10:34

  本文选题：毛囊干细胞　切入点：表皮干细胞　出处：《天津医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： 1、建立高效、快速的兔FSCs (Follicle stem cells, FSCs)和ESCs (Epidermal stem cells, ESCs)分离、培养技术,进行原代与传代细胞的培养。2、观察体外培养的兔FSCs和ESCs生物学特征、细胞周期,并比较两种细胞的差异。3、体外分离、培养人FSCs和ESCs,进行形态学观察。4、比较人FSCs和ESCs生物学特征。探讨更合适组织工程皮肤的种子细胞,为体外构建含有附属器官的人工皮肤和实现大面积皮肤损伤从结构修复到功能重建提供基础。 方法： 1、采用两步酶消化法从兔触须部和腹部皮肤分别获取FSCs和ESCs,进行原代与传代培养,用倒置相差显微镜观察细胞形态。 2、免疫组化检测兔FSCs和ESCs的表面标记物,β1整合素和角蛋白19(keratin19,K19)的表达差异。用MTT法考察FSCs和ESCs增殖活性。 3、采用流式细胞仪分析兔的第5代和第15代FSCs和ESCs各周期细胞的分布；比较经传代后两种细胞的生物学活性。 4、用荧光定量PCR技术检测传代培养的FSCs和ESCs K19,βl整合素在mRNA水平上的表达差异。 5、采用单细胞法和组织块法培养,分离培养人头皮来源的FSCs;分离培养人皮肤的ESCs,进行原代和传代细胞形态学观察。 6、比较人FSCs和ESCs体外贴壁时间、细胞形态结构、生长曲线和细胞增殖活性的差异。 结果： 1、采用两步酶法成功地分离出兔的FSCs和ESCs,FSCs分离培养2天丌始有细胞贴壁,3天时贴壁的细胞有明显的聚集倾向,7天后克隆增大丌始融合,传代培养的FSCs贴壁迅速,细胞培养8天达到完全融合。ESCs培养10天细胞才有克隆样生长趋势;传代培养细胞贴壁缓慢,细胞培养2周80%融合。 2、免疫组化染色结果显示,兔FSCs和ESCsβ1整合素、K19免疫染色均阳性表达。FSCs和ESCs生长曲线的比较除第2天无明显的差异外,从第6天丌始FSCs的增殖活性明显高于ESCs,具有统计学意义(P0.05),第10、14、18天FSCs的增殖活性逐渐增强,直到第26天,增殖活性开始下降；ESCs在第10天达到了增殖最高峰后细胞增殖活性迅速下降。FSCs显示出持续高增殖,其高增殖时间是ESCs的2倍。 3、流式细胞仪分析细胞周期结果显示,传代培养的FSCs和ESCs随代次延长S期百分比和PI值均有下降,同代次细胞FSCsPI值大于ESCs。 4、荧光定量PCR检测兔FSCs和ESCs的β1整合素和K19基因表达,显示FSCsβ1整合素和K19mRNA表达明显高于ESCs。 5、“两步酶”分离法可获取大量人FSCs和ESCs;单细胞培养FSCs细胞大部分在24h内贴壁,传代细胞增殖迅速,3天左右达到80%以上融合。组织块培养5天可见细胞在组织周围爬出,细胞呈表皮样。生长迅速,15天时可见表皮样细胞周围出现成纤维样的细胞。ESCs培养3天时细胞多悬浮生长。传代细胞增殖缓慢,培养7天细胞达到80%融合。 6、人FSCs和ESCs β1整合素、K19免疫染色均阳性。FSCs与ESCs生长曲线相比,FSCs具有更高的增殖活性且有一个相对较长高增殖活性的生长期。 结论： 1、“两步酶”消化法是一种安全、高效的FSCs和ESCs的分离方法。可在较短时间内为实验研究提供大量目标细胞。 2、人和兔来源的FSCs与ESCs均表达表皮干细胞标志β1整合素和K19,且FSCs显示高表达。 3、获取的FSCs和ESCs均具有较高的增殖能力,经体外培养的FSCs能在体外长时间扩增且细胞周期分布稳定。 4、FSCs和ESCs均可以作为皮肤组织工程的种子细胞,FSCs不仅获取容易且具有更高的增殖活性和多分化潜能,对构建全层工程皮肤,FSCs更有优势。
[Abstract]:Objective:
1, the establishment of efficient, fast rabbit FSCs (Follicle stem cells, FSCs) and ESCs (Epidermal stem cells, ESCs) separation and culture technique,.2 were cultured in primary and passage cells, cultured rabbit FSCs and ESCs biological characteristics, cell cycle, and the difference between the two kinds of cells.3 in vitro. Isolation, culture of human FSCs and ESCs, was used to observe the morphology of.4, FSCs and ESCs to compare the biological characteristics of more suitable seed cells of tissue engineering skin, for in vitro artificial skin containing subsidiary organs and achieve a large area of skin injury and provide the basis from the structure of repair to the reconstruction of function.
Method锛，

本文编号：1592962