抗黄曲霉素B1抗独特型多抗的制备及其性质分析

发布时间：2018-03-10 11:24

  本文选题：黄曲霉毒素B1　切入点：独特型抗体　出处：《华中农业大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1, AFB1)是由寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和产毒黄曲霉(A. flavus)代谢产生,是目前已分离的十几种黄曲霉毒素中最重要和毒性最大的毒素。AFB1主要污染大米、玉米、花生、花生油和动物肝脏、干咸鱼以及核桃、椰奶等农副产品。世界上几乎所有的国家和地区都规定了食品及饲料中AFB1的最大允许含量并将其作为强制性标准进行检测和控制。目前常用的检测AFB1的方法主要有薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)、以酶联免疫为基础的免疫分析以及生物传感器法等。这些方法虽各有优缺点,但都需要使用高浓度的AFB1标准品,检测人员对于频繁接触AFB1这种强致癌物质有很强的戒备心理；同时,AFB1标准品需要从国外进口,价格高昂,导致检测成本偏高。 而一种新型的免疫试剂——抗独特型抗体(anti-idiotype antibody, Aid),由于其在空间构象上与AFB1毒素抗原存在着所谓的内影像(internal image)关系,所以有望作为AFB1替代品用于AFB1的免疫学检测,从而实现AFB1的无毒检测,降低检测成本。 本实验目的在于通过制备AFB1抗独特型抗体来替代免疫学检测中的毒素标准品,从而建立无毒ELISA检测体系。实验首先采用胃蛋白酶酶切法对兔抗黄曲霉毒素抗体酶切,采用糖蛋白A柱分离纯化制得F(ab')2,并采用SDS-PAGE.琼脂糖双向扩散法对其进行了分析鉴定。随后,分别采用片段和完整抗体分子免疫了BALB/c小鼠,研究了不同免疫原产生的抗血清的差异,并采用ELISA对抗独特型抗体与毒素AFB1间的替代关系进行了研究,具体内容如下。 1.抗AFB1兔抗体的纯化及其酶切条件的优化 本研究首先以AFB1-BSA免疫日本大耳白兔得到的兔多克隆抗体为材料,采用饱和(NH4)2804盐析法对抗体进行纯化,采用SDS-PAGE和ELISA对纯化抗体进行了鉴定。以此为材料,采用胃蛋白酶酶切制备F(ab')2片段,并以蛋白A亲和层析法进行分离纯化,以SDS-PAGE、双向扩散法对F(ab')2片段的特性进行了分析。 以50%-33%-33%饱和(NH4)2804三步盐析法纯化抗体,回收率为25.7%。纯化后,在体积不变的基础上,抗体效价值从最初的7.88×105降为2.56×105,在原来基础上降低3倍,灵敏度都在20ng/mL左右,基本无变化。电泳结果显示,经纯化,大量杂蛋白被除去,得到的蛋白质大多数为IgG,基本达到电泳纯。 采用胃蛋白酶酶切IgG,通过对酶解条件的分析,得到最优水解条件为：0.4 mol/L NaAc, pH 4.0,酶与抗体比例为1：10(w/w),37℃水浴锅内反应4h；酶切前酸化前后抗体的比效价稍微有些下降,但变化不大。 2.抗独特型抗体的制备及其性质研究 以上述纯化得到的抗AFB1抗体(anti-AFB1 antibody, Ab1)及其酶解片段F(ab')2为抗原,分别免疫BALB/c小鼠,制备它们的抗独特型抗体(anti-idotype antibody, Ab2)。以Ab1为免疫原时,免疫剂量为50 gg/次/只,共3只(1-3号)小鼠,免疫周期为14d；以F(ab')2为免疫原时,免疫剂量为100μg/次/只,共3只(4-6号)小鼠,免疫周期为14d。抗体产生进程分析结果表明,小鼠均对Ab1和F(ab')2产生了很好的免疫应答,制备得到了相应的Ab2。在此基础上,对Ab2的性质进行了分析,结果如下。 采用pH分别为6.0、7.4、8.0的PBS (phosphate buffered saline),以及pH为9.6的CBS (carbonate buffer solution)等不同pH缓冲液对Abl的包被条件进行了研究。结果表明,pH 8.0的PBS缓冲液为最优包被液。以该pH值的缓冲液包被Abl,对2号小鼠Ab2血清做方阵滴定试验,确定Abl最佳包被浓度为0.25μg/mL。采用上述包被条件,对各小鼠Ab2抗血清的ELISA效价进行了分析。结果表明,1、2、3号小鼠的Ab2的ELISA效价分别为1：1.02×106、1：1.02×106、1：2.05×106；4、5、6号小鼠的效价为1：3.2×104、1：6.4×104、1：1.6×104。由此可以看出,以完整分子免疫的抗体Abl为抗原的效价要明显高于其片段F(ab')2的效价。初步推断,抗体的Fc片段可以增强小鼠的免疫应答。 进一步以1μg/mL AFB1-cOVA为包被抗原,以Ab1为抗体,采用间接竞争ELISA对Ab2的性质进行了分析。结果表明,以AFB1标品对Ab1做标准曲线时,灵敏度为6.82 ng/mL;以2号小鼠的Ab2对Ab1做标准曲线时,灵敏度为85.51μg/mL,相当于6.82 ng/mLAFB1,检测限为0.65μg/mL,线性范围为0.01-200μg/mL；以4号小鼠的Ab2对Ab1做标准曲线时,灵敏度为28.24μg/mL;相当于6.82ng/mLAFB1,检测限为0.01μg/mL,线性范围为0.01～100μg/mL。内影像实验表明,以4号小鼠的血清与AFB1的结构类似性优于2号小鼠,故以F(ab')2片段为免疫抗原得到的Ab2质量优于以Ab1为抗原的Ab2,与文献报道的相同。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

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本文编号：1593133