新型HCV感染细胞模型及小鼠模型研究

发布时间：2018-03-11 08:03

本文选题：丙型肝炎病毒　切入点：第三代腺病毒　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要因素之一，其慢性化及致癌率高，是严重威胁人类健康的公共卫生问题。目前尚缺乏有效的HCV预防性疫苗，这进一步增加了HCV的防控难度。HCV具有高度种属特异性，仅能感染人和黑猩猩，不能自然感染小鼠，致使HCV感染性模型缺乏，严重阻碍了HCV复制及致病机制研究、抗病毒药物及疫苗研制与评价等。建立新型HCV感染性细胞模型及小动物模型，对HCV基础及应用研究具有重要意义。本研究分别利用Tet-on可诱导系统和第三代腺病毒载体系统，探索并建立了新型HCV感染细胞模型及小鼠模型，，以期为HCV复制与致病机制研究、疫苗及抗病毒药物评价等提供一个新的技术手段。 1.肝组织特异性可诱导uPA转基因小鼠模型研究 (1)可诱导uPA转基因人肝嵌合小鼠模型的建立及鉴定人肝嵌合小鼠模型是将人肝细胞异种移植到受体鼠肝内建立的适合于嗜肝病毒体内感染研究的小鼠模型，现有的Alb-uPA/SCID转基因人肝嵌合小鼠模型，由于在肝组织特异性白蛋白（Albumin）启动子作用下组成性表达小鼠尿激酶原激活剂（urokinase-type plasminogen activator, uPA）分子，造成出生小鼠肝损伤，为人肝细胞的移植及嵌合生长提供了微环境；但其严重不足之处是小鼠出生时死亡率高达70%~90%，使得该模型稳定性差，繁育及操作难度大。因此，建立繁育和操作简单、稳定性好和死亡率低的模型是发展该模型的关键。为了降低Alb-uPA/SCID小鼠出生时高死亡率，增强模型稳定性，本研究采用Tet-on可诱导系统建立了一种可诱导uPA转基因表达的人肝嵌合小鼠模型。首先，我们分别构建了Tet-on-Albumin和TRE_2-uPA转基因载体，在体外证实了Albumin启动子具有体外转录活性，并且Dox可诱导活性uPA分子表达。在此基础上，我们分别制备了Tet-on-Albumin和TRE_2-uPA两种转基因小鼠。实验结果显示Albumin启动子也具有体内转录活性，可调控性rtTA蛋白在Tet-on-Albumin转基因小鼠肝组织特异性表达。研究结果显示Dox可诱导uPA在Tet-on-Albumin/TRE_2-uPA双转基因小鼠肝组织特异性表达，且渗漏表达率极低，Tet-on-Albumin/TRE_2-uPA/SCID小鼠经Dox诱导后进行了HepG2和Huh-7细胞脾内移植。结果显示，其有效嵌合度可达30%，小鼠死亡率低于5%。本研究成功建立了一种肝组织特异性可诱导uPA转基因小鼠模型，并且以此为基础建立了可诱导型uPA转基因人肝嵌合小鼠模型，为进一步开展HCV感染研究以及抗病毒药物评价奠定了基础。 (2)可诱导uPA转基因小鼠模型用于HBV转染及HCV感染研究本研究将可诱导Tet-on-Albumin/TRE_2-uPA双转基因小鼠应用于pAAV-HBV水动力转染模型研究。结果显示，与Dox未诱导小鼠相比，Dox诱导的Tet-on-Albumin/TRE_2-uPA双转基因小鼠转染pAAV-HBV后，HBV基因组在小鼠体内复制表达明显增加，小鼠肝脏炎性损伤显著加重，血清中白介素-6及肿瘤坏死因子α显著升高(p0.01)，肝组织病理损伤加重，AFP基因转录水平升高。相比于C57BL/6小鼠，可诱导Tet-on-Albumin/TRE_2-uPA双转基因小鼠更适合HBV水动力转染模型的建立，其应用于uPA与HBV病毒复制及致病机制研究具有更显著的优势。此外，本研究以可诱导uPA转基因人肝嵌合小鼠模型为基础，进一步开展了HCV阳性血清感染研究。通过尾静脉接种HCV阳性血清后， HCV蛋白和RNA检测为阴性。其原因可能是HCV阳性血清感染滴度较低或小鼠种属特异性等综合因素所致，具体原因有待进一步探索。相比于直接利用阳性血清接种感染，利用具有高转导效率的载体介导HCV感染，其稳定性和有效性或将提高。可诱导uPA转基因小鼠模型的建立，为进一步开展HBV转染及HCV感染研究奠定了基础。 2.第三代腺病毒介导的HCV全基因组细胞模型及小鼠模型研究现有的人肝嵌合小鼠模型属于免疫缺陷型小鼠，不能有效应用于肝炎病毒感染致病、免疫感染机制及疫苗研究和评价等方面。因此，建立非免疫缺陷型（即正常免疫状态）的可用于HCV复制与致病机制研究、疫苗及抗病毒药物评价的小鼠模型，已成为HCV模型研究新的重要方向。采用转基因技术或病毒载体介导病毒基因组建立相应的动物模型是值得探索研究的新的技术途径。为了建立具有正常免疫状态的HCV小鼠模型，本研究采用辅助病毒依赖型腺病毒(HDAd,helper-dependent adenovirus)载体介导HCV全基因组，探索建立制模简便而模型稳定的HCV新型细胞模型和小鼠模型。HDAd是第三代腺病毒载体，又称空壳载体，由于去除了腺病毒全部的编码反式作用蛋白的基因（功能由辅助病毒提供），仅保留了两端反向末端重复序列(ITRs, inverted terminal repeats)以及包装信号(Ψ)，因而其包装容量高达37kb，可用于HCV全基因组的包装；而目前常用的其他病毒载体因包装容量限制，无法用于HCV约10kb全基因组的包装及递送。HDAd具有高滴度、高转导效率、低毒性以及肝组织嗜性等优点，也使其非常适合HCV全基因组呈递。本研究首次利用HDAd包装HCV全基因组，进行HCV全基因组细胞模型以及小鼠模型的建立和评价研究，以期为HCV复制与致病机制研究、疫苗及抗病毒药物评价提供一个新的技术手段。 (1)第三代腺病毒介导的HCV全基因组细胞模型虽然近年来，HCV感染性细胞模型取得一定进展，以Huh-7细胞及其衍生细胞系为基础，先后建立了HCV2a型JFH1全基因组体外转录RNA瞬时转染细胞模型以及JFH1基因组cDNA稳定转染细胞模型，以上两种转染模型均能支持HCV的有效复制及病毒产生，但转染性细胞模型对转染细胞的状态和转染条件要求较高，其可重复性及稳定性有待进一步提高。本研究采用HDAd介导HCV全基因组感染的一种新的技术途径，探索建立操作简便和模型稳定的HCV感染细胞模型。首先在HCV2a型JFH1全基因组3’加入一个HDV核酶位点后将其连入HDAd载体中，通过辅助病毒AdNG163实现重组HDAdJFH1病毒的包装、扩增及梯度离心纯化，得到较高滴度的重组HDAdJFH1病毒，进而建立HDAd介导的HCV全基因组细胞模型。细胞免疫荧光、Western blot及Northern blot结果显示，HDAd介导了HCV core、NS3蛋白以及HCV RNA在Huh-7细胞中的有效表达。实时定量结果显示，细胞培养上清中HCV RNA水平最高可达1.8×107拷贝/ml。另外，上清再感染的细胞免疫荧光、抗体阻断以及透射电镜和免疫电镜结果均表明，细胞及培养上清中产生了感染性HCV病毒颗粒。实验研究表明，通过HDAd介导，我们建立了一种新型HCV感染性细胞模型，该模型可稳定连续传代，有效支持HCV复制及感染性HCV产生，HCV感染性滴度最高达1×103ffu/ml。同时该细胞模型也可用于α干扰素等抗病毒药物评价。实验结果还显示，HDAd同样能介导HCV1b型Con1全基因组感染性细胞模型的建立。这对建立不同基因型的HCV细胞模型和进行相关抗病毒药物评价等具有重要意义。 (2)第三代腺病毒介导的HCV全基因组小鼠模型 HCV具有高度种属特异性，仅能感染人和黑猩猩，不能自然感染小鼠，目前尚无法实现HCV在非免疫缺陷型小鼠体内复制和感染。本研究通过HDAd介导HCV全基因组小鼠模型的建立，通过辅助病毒AdNG163实现重组HDAdJFH1病毒的包装、扩增，经梯度离心纯化后，HDAdJFH1病毒滴度可达2×1011病毒颗粒数(viral particle, vp)/ml，将1×1010vp HDAdJFH1以及HDAdGFP病毒分别通过尾静脉注射入C57BL/6小鼠体内建立了由HDAd介导的HCV2a型JFH1全基因组小鼠模型。结果显示该小鼠模型可支持HCV的表达和复制，肝组织中可检测到HCV core、NS3蛋白以及HCV RNA，血清中HCV RNA水平可持续至感染后第8周。利用建立的HCV小鼠模型对抗-HCV药物miR-122拮抗剂进行了抗病毒效果评价，实验结果显示，miR-122拮抗剂在小鼠模型体内可有效抑制HCV的复制。该研究表明，建立的HDAd介导的HCV全基因组小鼠模型可应用于HCV药物研究和评价。这也为该模型在致病机制和疫苗评价等方面的研究奠定了基础。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.63;R-332

【参考文献】