肺脏NK细胞与呼吸道病毒感染

发布时间：2018-03-14 10:41

本文选题：肺脏稳态　切入点：肺脏损伤　出处：《中国科学技术大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：自然杀伤细胞（Natural Killer cells, NK细胞）是构成机体防御第一道防线的固有淋巴细胞之一。NK细胞能够通过多种受体传递活化或者抑制信号。活化性受体包括自然杀伤受体（NCRs），如NKp46和NKp44、Fc受体CD16以及NKG2D。抑制性受体包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）以及NKG2A:CD94二聚体。同时，NK细胞也可以被细胞因子活化，如I型干扰素、IL-12和IL-18。NK细胞一旦被活化就能够通过释放杀伤颗粒到突触部位直接杀伤靶细胞。由于NK细胞的功能已经远远超出自然杀伤细胞的功能，我们对NK细胞的认识也在快速地更新。最重要的是，NK细胞是重要的早期细胞因子的来源，特别是分泌IFN-γ，也可以分泌Th2相关的细胞因子，比如IL-5，IL-13以及调节性细胞因子IL-10。此外，NK细胞还能够与树突状细胞和巨噬细胞相互活化以及能够影响获得性免疫应答的产生。NK细胞与病毒感染之间的关系一直是免疫学研究的热点之一，近年来的研究发现NK细胞在病毒感染中扮演了抵抗病毒感染保护机体或者导致损伤促进疾病发生的双重角色。肺脏是一个很特殊的器官，时时刻刻接受来自外界环境中的非己物质以及各种微生物的刺激。肺脏特殊的环境决定了其免疫系统的特殊性，比如肺脏免疫应答的阈值较高。NK细胞在特殊的组织中也会有特殊的功能，比如最近发现的在肠道和扁桃体存在分泌IL-22的NK细胞，这种细胞之后被证明在肺脏细菌和病毒感染中也均会出现。呼吸道是外界病原体进入机体的重要通道，NK细胞快速应答感染的能力就意味着它在急性的肺脏感染中有举足轻重的作用。那么，肺脏NK细胞在表型和功能上与其他组织器官的NK细胞有何不同呢？这正是我们所关心的问题。本论文的目的在于研究肺脏NK细胞在呼吸道病毒感染中的重要作用，重点探讨了小鼠肺脏NK细胞在呼吸道合胞病毒（RSV）感染中的作用，并比较了小鼠肺脏与其他脏器NK细胞的表型差异，以期为更好地全面地理解肺脏NK细胞的功能提供线索。在本论文中，我们分离了BALB/c和C57BL/6小鼠淋巴结、骨髓、脾脏、外周血、肝脏和肺脏的单个核细胞，通过流式细胞术检测了NK细胞的表型；利用6~10周的成年SPF级BALB/c雌性小鼠，通过鼻腔接种106PFU的人RSV病毒悬液建立RSV感染模型；利用HE染色的方法检测小鼠肺脏的病理改变；通过ELISA方法检测小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞因子的水平；利用流式细胞术检测肺脏淋巴细胞亚群比例的变化，以及淋巴细胞表面分子的表达情况；利用胞内细胞染色的方法检测NK细胞细胞因子以及功能分子的产生；采用尾静脉注射兔抗小鼠抗AsGM-1抗体来清除小鼠NK细胞。通过以上一系列的研究方法，我们得到了如下的实验结果： 1.小鼠肺脏存在高比例的NK细胞首先我们比较了正常小鼠不同脏器NK细胞的比例，发现在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠中，NK细胞在不同脏器中的分布是有区别的。在淋巴结中NK细胞的比例仅占淋巴细胞的0.5%左右；在骨髓和脾脏中NK细胞比例在2%左右；在外周血中NK细胞比例略高，占到了3~4%；在肝脏中NK细胞比例较高，占到了6~8%，在肺脏中NK细胞比例最高，占了10~12%。因此，按照NK细胞比例从高到低排序应该是肺脏肝脏外周血脾脏骨髓淋巴结。 2.小鼠肺脏NK细胞有较成熟的表型通过对C57BL/6小鼠各脏器NK细胞表面CD27和CD11b分子的检测，我们发现肺脏NK细胞中CD27lowCD11bhigh的群体与其他脏器NK细胞相比比例最高（大于70%），而肺脏NK细胞中CD27lowCD11blow，CD27highCD11blow和CD27highCD11bhigh的这三个群体却比其他脏器比例都低。此外，肺脏NK细胞中表达DX5、CD11b、CD122、Ly49s、CD43的比例较其他脏器NK细胞都高，尤其DX5、CD11b、CD122和CD43表达的比例都在90%以上，而肺脏NK细胞表达CD51分子的比例（仅0.6%）却较其他脏器NK细胞都低。因此，基于这样的表型，说明肺脏NK细胞在发育上可能处于较成熟的阶段。 3.小鼠肺脏NK细胞处于静息状态比较分析了肺脏与骨髓和脾脏NK细胞的表型差异，发现肺脏NK细胞表面表达较高的抑制性受体，如CD94和NKG2A，而表达较低的活化性受体，如NKp46、NKG2D和CD69；而且肺脏NK细胞表面与迁移相关的分子表达均较低，如粘附分子CD11a、CD18、CD244、CD48、CD62L、CD44和CD11c，趋化因子受体CCR5和CXCR2；此外，肺脏NK细胞上共刺激分子的表达也是较低的，如CD86、B220、CD1d、PDL1和PD1等。这些结果都表明在正常状况下肺脏NK细胞处于一个非活化的静息状态。 4.呼吸道微生物感染诱导NK细胞活化并获得功能通过给小鼠呼吸道感染流感病毒、金黄色葡萄球菌或者肺炎克雷伯菌，发现这些感染都能够在3天之内对肺脏NK细胞有不同程度的活化，，使其表面活化性标志CD69分子的表达上调。在这些微生物感染过程中虽然脾脏NK细胞也会有所活化，但其活化程度远不及肺脏NK细胞。通过检测肺炎克雷伯菌感染2天后小鼠肺脏NK细胞表达功能分子的情况。发现肺炎克雷伯菌的感染能够显著上调肺脏NK细胞表面CD107a、TRAIL以及FasL的表达，以及分泌IFN-γ和颗粒酶B的能力。以上结果表明，尽管肺脏NK细胞在正常情况下是处于静息状态，但是当有呼吸道感染时，肺脏NK细胞会迅速活化并且表达杀伤相关的分子和分泌细胞因子参与到宿主抵抗呼吸道感染的免疫应答中。 5．NK细胞参与RSV感染引起的小鼠肺免疫损伤通过RSV小鼠感染模型，发现RSV能够诱导严重的急性肺免疫损伤；在病毒感染的早期NK细胞大量聚集在肺脏并且被活化；活化的NK细胞高表达活化性受体NKG2D和CD27成为有功能的细胞，并且具有分泌大量IFN-γ的的能力。NK细胞的清除能够显著减轻肺免疫损伤，并且减少BALF中炎症细胞的浸润以及降低BALF中IFN-γ的水平。这些结果均表明在RSV感染早期NK参与了急性肺免疫损伤，并且这个过程是通过分泌IFN-γ来实现的。综上所述，本论文的研究得到以下结论：在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠肺脏分布着高比例的NK细胞，这些NK细胞具有较成熟的表型。当呼吸系统在正常状态时，肺脏NK细胞是处于静息状态的。当呼吸道有感染发生时，肺脏NK细胞会在较短时间内活化并且发挥其功能；发现在呼吸道合胞病毒感染过程中NK细胞在早期参与了的急性肺免疫损伤的发生，并且这一过程是通过NK细胞分泌IFN-γ来实现的。本研究全面描绘了小鼠肺脏NK细胞的表型，并且阐述了NK细胞在肺脏稳态和肺脏损伤中的重要作用，为更好地理解肺脏NK细胞的功能提供了依据。
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【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

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