日本血吸虫抗原诱导巨噬细胞极化的分子证据

发布时间：2018-03-16 00:08

本文选题：日本血吸虫　切入点：抗原　出处：《南京医科大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病，在世界范围内广泛分布，全球七十四个流行国家中至今仍有约七亿人口受到血吸虫病威胁，两亿人口受到血吸虫病感染，其中有两千万人有较重的临床症状并伴有不同程度的劳动力丧失，且每年至少还有两万人死于血吸虫病。在我国流行的是日本血吸虫病，虽然经过半个多世纪的努力，血吸虫病的流行程度已大大减低。但是，至2010年底，在全国七个流行省份的92个县中仍有三十余万的血吸虫病患者。因此，血吸虫病的防治和研究工作仍然面临着严峻的挑战。作为一种危害严重的多细胞寄生蠕虫，日本血吸虫侵入宿主机体后可引发复杂的免疫应答。随着对日本血吸虫免疫学研究的不断深入，人类正在一层层揭开日本血吸虫与其适宜宿主人类之间关系的面纱。大量研究已归纳出日本血吸虫感染后宿主免疫应答的特征，即感染后最初的2-4周，宿主在移行中的童虫刺激下，呈现Th1型(IFN-g，TNF)优势应答；一旦成虫开始产卵，Th1型应答迅速下降，并持续呈现出Th2型（IL-4，IL-13，IL-10，IL-5）优势应答。可见虫卵抗原产生前后，宿主体内的细胞因子微环境也因此发生了变化。但到目前为止，对这一免疫现象背后更为深入的免疫机制还未被完全阐明。由此，继续探索这一免疫应答及其调节机制，从而通过人工调节，使免疫应答向着有利于人体的方向发展就显得极为重要。巨噬细胞在人类免疫系统中占有独特的位置，其是免疫系统第一个被确定的细胞成分,在机体正常生理过程和病理过程中发挥极其重要的作用。目前研究发现，在不同的环境中，巨噬细胞可以分化为行使特定免疫角色的不同细胞亚群。在不同微环境中，巨噬细胞主要分为两种类型：M1型，即经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophage)，其可直接吞噬和杀伤病原微生物和肿瘤细胞，分泌促炎因子和趋化因子，并通过递呈抗原参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能； M2型，即替代性活化的巨噬细胞(alternatively activatedmacrophage)。其可在M-CSF、 IL-4、 IL-13、 IL-10、糖皮质激素、转化生长因子-β(TGF-β)、维生素D3和前列腺素E2(PGE2)等作用下诱导产生，其抗原递呈能力较低，并通过分泌IL-10、 CCL17、 CCL18、 CCL22和TGF-β等抑制性细胞因子下调免疫应答。根据固有免疫参与并调控适应性免疫应答的启动，和影响特异性免疫应答的强度与类型，以及抗原刺激启动和调节适应性免疫应答的关键在于Mφ和DC等固有免疫细胞作用的认知，研究在血吸虫感染中固有免疫细胞与抗原相互作用可能发挥的免疫调节影响应是理所当然的关注重点。鉴于Mφ是血吸虫虫卵肉芽肿炎症中的主要细胞成分，而血吸虫感染全过程的宿主免疫应答经历了由I型（Th1）向II型（Th2）的漂移，漂移的结点正好是以成虫产卵为界，提示了Mφ在此过程中可能发挥重要的免疫调节功能并推论：通过成虫产卵前后抗原微环境的剧烈改变，从而诱导Mφ极化分型来指导和/或调节适应性免疫应答类型。本研究以这一设想作为我们关注的重点，通过体内体外实验证明血吸虫抗原刺激和巨噬细胞极化的相互关系，并探明Mφ极化分型的分子证据。本研究实验设计的技术路线为：在体外使用经典的M1诱导剂IFN-γ/LPS和M2诱导剂IL-4诱导处于M0状态的小鼠巨噬细胞瘤系RAW264.7，建立以RAW264.7为试验用细胞的巨噬细胞极化属性识别系统，为了鉴定系统建立是否成功，分别对已报道的多个Mφ极化表型指标进行了检测；为了考察日本血吸虫生活史不同发育阶段来源抗原诱导下巨噬细胞的极化情况，在体外，使用不同的日本血吸虫抗原（正常尾蚴抗原NCA,辐照尾蚴抗原ACA,可溶性成虫抗原SWAP,可溶性虫卵抗原SEA）刺激RAW264.7，在体内，获得日本血吸虫自然感染不同阶段来源的腹腔巨噬细胞(感染前0w，感染后3w，6w，9w)，分别从精氨酸代谢途径，表面标志和细胞因子分泌三个方面对巨噬细胞极化类型进行了鉴定；为了证明不同极化状态下的巨噬细胞参与了血吸虫感染的免疫调节，运用ELISA方法分别从蛋白水平检测不同来源日本血吸虫抗原作用下巨噬细胞效应/抑制分子的表达；为了探明Mφ极化分型跟TLRs及相应通路的联系，采用抗体封闭实验考查TLR2和TLR4在巨噬细胞极化中的作用；此外，还运用流式细胞术检测M1/M2极化状态下，共刺激分子和共抑制分子的表达。主要研究结果如下： 1.在本实验室条件下，成功建立了有效的Mφ极化分型的识别系统。 M1诱导剂IFN-γ/LPS和M2诱导剂IL-4可诱导处于M0状态的小鼠巨噬细胞瘤RAW264.7，分别极化为M1和M2。 2.日本血吸虫不同发育阶段来源抗原可诱导Mφ向不同方向极化。日本血吸虫正常尾蚴抗原NCA和辐照尾蚴抗原ACA都可刺激RAW264.7细胞相对于未刺激组表达高水平的inos，CD16/32也呈现出高表达，IL-12产生显著增加(p0.01)，但NCA和ACA间无差异；日本血吸虫虫卵抗原SEA刺激RAW264.7细胞相对于未刺激组,IL-10产生显著增加, CD206显示了高表达，表达高水平的arg1。结果表明NCA和ACA可诱导Mφ向M1极化，SEA可诱导Mφ向M2极化，SWAP中因为成分复杂（含有SEA）可同时诱导M1和M2增加。 3.日本血吸虫自然感染过程中存在Mφ极化漂移的现象。即随着感染发展的进程，M1细胞表面标志的CD16/32表达在3周达到最高，从6周开始逐渐降低；M2细胞的表面标志CD206的表达从3周开始逐渐升高，在第9周达到最高。但在3-9周，我们还观察到腹腔巨噬细胞根据F4/80荧光强度不同分为两群，因为我们未能找到合适的技术手段分离这两群巨噬细胞，并分别鉴定这两群细胞的极化属性，于是我们继续通过检测细胞因子IL-12、IL-10分泌和相关因子iNOS、Arg-1基因的表达来鉴定全部巨噬细胞的优势极化属性。结果表明，产卵前腹腔巨噬细胞IL-12的基础分泌量最高，之后表达逐渐减少，而IL-10的基础分泌量在6w后开始显著增加；inos的表达在3w达到最高，arg1在产卵后表达显著升高。证明了产卵前巨噬细胞以M1方向极化为主，产卵后趋于M2方向。 4.巨噬细胞极化后通过分泌细胞因子参与调节日本血吸虫感染过程中的免疫应答。巨噬细胞分泌的正向效应分子（TNF-α，IL-12）在产卵前占优势，而负向调节分子（IL-10，TGF-β）的分泌在产卵后占优势。 5. TLR4信号通路的存在会对巨噬细胞的极化产生影响。TLR2被拮抗后对CD16/32和CD206的表达，细胞因子IL-10和IL-12的分泌，iNOS和Arg-1的表达都没有显著性影响。而TLR4被拮抗后，NCA刺激Mφ后CD16/32和iNOS的表达与对照组相比显著降低（P0.01），提示TLR4信号通路的存在对巨噬细胞向M1的极化有显著的影响。而SEA刺激的CD206，IL-10，Arg-1的表达与对照组相比表达变化没有显著性，原因待深入探索，可能与拮抗剂的剂量依赖性有关。 6.共刺激分子CD40，CD86和共抑制分子PD-L1在不同发育阶段来源的抗原刺激下表达均上调，故未发现正向和负向调节的共刺激分子可直接对应调节巨噬细胞极化属性的证据。但NCA刺激巨噬细胞表达的PD-L1显著高于SEA和SWA，NCA刺激巨噬细胞表达的CD86也显著高于SEA和SWAP，提示如果共刺激分子参与巨噬细胞的极化的话，并不单一地依赖正向或负向调节的共刺激分子的作用，而可能取决于我们尚未认识的正向或负向信号间微妙的平衡调节。关于共刺激信号参与巨噬细胞极化调节及调节机制，在本研究中还只是停留在对实验观察结果的直观描述和推论上，，但却给我们留下了丰富的想像空间。综上所述，本研究明确了抗原微环境的变化确实是巨噬细胞极化的关键。不同日本血吸虫抗原可以刺激巨噬细胞向不同类型极化，从而参与对日本血吸虫感染引起的机体免疫应答变化的调控，如对细胞免疫方面由Th1向Th2方向的极化有所贡献。这为未来从巨噬细胞极化属性调节入手，寻找可供发展新型免疫抑制剂的虫源性成分提供先导性实验论据。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

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