体外重编程人脐带间充质干细胞向胰腺前体细胞分化的研究
发布时间：2018-03-16 08:47
本文选题：脐带 切入点：间充质干细胞 出处：《汕头大学》2011年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的：研究人脐带间充质干细胞（Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem cells，HuMSCs）转染腺病毒携带外源基因pdx1 ngn3 mafa后，向胰腺前体细胞分化潜能。 方法： 1.人脐带间充质细胞的培养及鉴定：人脐带华尔通胶组织块培养原代huMSCs，传代培养，流式细胞仪检测鉴定HuMSCs的表面标记和免疫原性标记。 2.腺病毒的扩增及制备：利用AD293细胞扩增腺病毒，收集到的腺病毒行梯度稀释后，进行浓度测定，储存在-70度超低温冰箱备用。 3.腺病毒携带外源基因pdx1、ngn3、mafa转染HuMSCs及鉴定：腺病毒携带β细胞发育的关键转录因子（pdx1、ngn3、mafa）体外转染第三、四代人脐带间充质干细胞，细胞免疫荧光化学检测腺病毒是否转染进入HuMSCs内；CCK-8检测转染诱导后HuMSCs增值能力。 4. HuMSCs转染携带外源基因pdx1、ngn3、mafa腺病毒后向胰腺前体细胞分化的鉴定：转染腺病毒后倒置相差显微镜下观察诱导后细胞形态学变化，RT-PCR和荧光定量PCR对诱导细胞进行相关基因（glucagon、pdx1、nkx2.2）鉴定。应用2-ΔΔCT比较各组在不同诱导方式，不同时间内源性基因水平。 结果： 1.脐带间充质（华尔通胶）组织块原代培养7天，贴壁组织块周围有细胞爬出,呈成纤维i叵赴Ａ魇较赴羌觳獾谌恋谖宕腍uMSCs表面标记，Oct4(45.2%)、CD29(89.64%)、CD59(91.19%)、CD80(0.11%)、CD86(0.08%)、CD40(0.03%)、CD40L(0.07%), 2.腺病毒携带三种基因单独或者是联合转染HuMSCs后，荧光显微镜下观察腺病毒已进入细胞内;CCK-8检测细胞增值显示，在感染复数（MOI）为50的情况下，腺病毒进入细胞内细胞增殖组间无差异。 3.倒置相差显微镜下观察转染后的HuMSCs细胞培养三天或者七天细胞形态未见明显变化；RT-PCR检测到基因glucogon（GCG）,neuroD1，测序匹配率分别为93.21%，93.91%；荧光定量PCR显示转染诱导后HuMSCs表达人源性胰腺前体细胞相关基因glucagon(GCG)、pdx1、nkx2.2基因； 3.1 GCG基因诱导表达：HuMSCs第三天即有三种基因联合诱导3天和7天时最高（均为21倍），7天时GCG基因表达水平与三天相比较无明显差别；mafa与ngn3两个基因联合诱导水平次之三天14倍、七天15倍, mafa在内源性GCG基因产生过称中起到关键作用。 3.2 pdx1基因诱导表达：在3种基因共同联合诱导培养三天时最高（15倍），mafa单独作用转染诱导pdx1基因表达水平可提高6倍，与pdx1或者是ngn3联合作用时并不能促进pdx1基因表达水平；诱导七天时mafa与ngn3协同作用pdx1基因表达水平最高5倍，ngn3单独诱导次之；对转染后培养七天与三天pdx1基因水平进行比较，三种基因联合诱导作用条件下pdx1基因无提高，而pdx1单独诱导培养7天可提高7倍，对于内源性pdx1基因诱导能力最强，随着培养时间延长，基因表达水平升高。 3.3 nkx2.2基因诱导表达：在ngn3单独诱导培养三天时最高（8倍），mafa与ngn3联合诱导次之（4.5倍）；诱导培养7天时pdx1和mafa联合转染诱导nkx2.2水平无提高、pdx1和ngn3联合（2.5倍），其他组pdx1、ngn3、mafa、ngn3与mafa联合、三种基因共同作用时转染诱导nkx2.2基因水平差别无意义2倍。诱导后培养3天和7天时nkx2.2基因水平比较结果为：除ngn3单独作用和mafa与ngn3联合时nkx2.2基因水平无提高外，ngn3对于内源性nkx2.2基因诱导作用在培养至第三天时达到最高水平，随培养时间延长时间而出现抑制作用，其他组均较3天时提高，pdx1可提高nkx2.2水平为11倍，Pdx1单独作用时对于内源性nkx2.2基因诱导能力最强，随着培养时间延长，基因表达水平升高。 结论： 腺病毒携带胰岛β细胞发育的三个关键基因pdx1、ngn3、mafa单独或者是联合转染人脐带间充质干细胞，诱导胰腺早期基因GCG、pdx1、nkx2.2、neuroD1表达。不同外源性基因对特定基因产生过称中起到关键作用，，并且在内源性基因产生过程存在时间差异性和组合内基因的拮抗作用，当基因表达量达到一定程度，不会随培养时间延长而增加，有待做进一步的研究，探索最佳基因诱导时间及组合方式。该发现为进一步探索基因治疗1型糖尿病治疗提供基础。
[Abstract]:Objective: To study the differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells (Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem cells, HuMSCs) into pancreatic precursor cells after transfection of adenovirus with PDX1 Ngn3 MafA.
Method锛
本文编号：1619171
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