地域差异对中国猫源弓形虫基因分型和毒力影响的研究

发布时间：2018-03-19 10:48

  本文选题：弓形虫　切入点：PCR-RFLP　出处：《安徽医科大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的本实验主要目的是探讨国内猫体内弓形虫的基因型别是否会因为地域差异而产生不同,同时观察从猫体内分离到的弓形虫的毒力强弱。 方法分别从安徽,湖北,山西和广东四省收集猫的标本,其中安徽22只,湖北23只,山西24只,广东20只。每只猫都用乙醚麻醉后杀死,取脑、舌、心脏组织各20克左右。将猫的脑、舌和心脏在剔除结缔组织后放入一个50m1的离心管中并用剪刀剪碎、碾钵碾压成肉糊状。然后,将这些糊状物静置于10ml无菌生理盐水中,再加入同体积的盐酸胃蛋白酶。将该混合液置37℃水浴摇床中摇匀一个小时后进行离心,调节PH并加入抗生素。取上述混合液,腹腔注入5只小鼠,每只注入0.5m1。密切观察小鼠,当发现有明显的症状时,杀死小鼠并抽取腹腔液于显微镜下观察,最后总共发现14株弓形虫。为了观察每株弓形虫的毒力,我们随机选择了14组(每组10只)6周龄昆明雌鼠,每只小鼠腹腔感染约1000个速殖子。逐日观察并记录小鼠的发病及死亡情况。在小鼠即将死亡前从其腹腔液中提取弓形虫的DNA。总共选择9个基因位点SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、L358、PK1b、c22-8、c29-2和Apico。PCR反应体系25u1。包含2ul PCR buffer、2.5ul MgCl2、2ul dNTPs、0.5mM的上下游引物、0.3单位的ExtraDNA酶、lul DNA样本和18.2u1H2O。参考虫株为Ⅰ(RH株),Ⅱ(PRU株)和Ⅲ(CTG株).为了明确每株的型别,取10ul的PCR产物,然后用相应的内切酶酶切,反应条件参照每种酶的特定温度,酶切后产物用2.5%的琼脂糖凝胶电泳,将待检株同三个标准基因型别进行比较。 结果从四省收集的89只猫体内共收集到14株虫株,分别命名为Tgctys1、Tgctys2、Tgctwh1、Tgctwh2、Tgctwh3、Tgctwh4、Tgctwh5、Tgctwh6、Tgctwh7、Tgctwh8、Tgctgd1、Tgctgd2、Tgctsx1、Tgctsx2。四省猫源性弓形虫的分检率以湖北省最高达到34.8%,其余三省均在10%左右。除Tgctwh6和Tgctwh8为弱毒株外,其余各株均为强毒株,在感染的120只小鼠中,有115只在感染后4-8天死亡(死亡率95.8%)。PCR-RFLP的分型结果发现了两个基因型别,命名为#1和#2型,二者均为杂合型。#1型在各个位点的鉴别结果是：在SAG2、GRA6、L358、PK1b、C22-8和C29-2位点同参考株Ⅱ；在SAG3、BTUB位点同参考株Ⅲ；在Apico位点同参考株为Ⅰ。#2型在SAG3,、BTUB和GRA6三个位点上显示较为特别的电泳条带均不同于上述参考株,其它其余各位点同#1。没有发现经典典型的Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ型株。其中有12株为#1型,占到85.7%。本次发现的#1同朱兴权等前期对中国广东省猫体内弓形虫研究中占82.2%的#3基本相同。#2基因型过去在我国未见报道。为成囊的弱毒株,在感染的20只小鼠中,只引起2只死亡。 结论1.从本次实验来看地域的变化对中国国内猫体内的弓形虫基因型别的影响较小。且从分离到的基因型别分析是以杂合型为主。#1占到85.7%可能为流行我国的主要基因型2.#1对小鼠有较强的致死率。3.#2是首次在中国发现说明也是有少数其它的基因型别存在于猫的体内。
[Abstract]:Objective to investigate whether the gene types of Toxoplasma gondii in domestic cats are different due to regional differences, and to observe the virulence of Toxoplasma gondii isolated from cats. Methods the cat specimens were collected from Anhui, Hubei, Shanxi and Guangdong provinces, including 22 cats from Anhui Province, 23 from Hubei Province, 24 from Shanxi Province, and 20 from Guangdong Province. The brain, tongue and heart of the cat were removed from connective tissue and placed in a 50m1 centrifuge tube, shredded with scissors and crushed into a meat paste. Then, the paste was statically placed in 10 ml sterile saline. Then add pepsin hydrochloride of the same volume. Shake the mixture in 37 鈩，

本文编号：1633941