CD3ζ RNAi重组质粒的构建及对T细胞信号转导的作用研究

发布时间：2018-03-22 15:15

本文选题：CD59　切入点：CD3　出处：《青岛大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：采用前期已构建的CD59pSUPER-RNAi质粒转染Jurkat细胞,探讨特异性沉默CD59前后CD59对CD3介导Jurkat细胞活化信号转导的相关作用。方法：应用Lipofectamine2000转染病毒包装细胞系PA317,然后收集病毒的上清感染Jurkat细胞,经G418压力筛选建立稳定转染细胞系,利用RT-PCR检测转染后CD59在基因水平的表达抑制效果。实验分为未转染的Jurkat细胞组,转染空质粒pSUPER组和转染CD59pSUPER-RNAi质粒的Jurkat细胞组,采用噻唑蓝(MTT)比色法、Western Blot技术和激光共聚焦显微镜来分别检测交联CD59单抗与固相化CD3单抗联合作用后对三组细胞的细胞增殖效应、ZAP-70酪氨酸的磷酸化水平以及细胞浆内钙离子的变化水平。结果：重组干扰载体转染后,经G418压力筛选得到稳定转染细胞系,且RT-PCR结果表明转染CD59pSUPER-RNAi质粒的Jurkat细胞组CD59分子的表达被抑制。转染干扰质粒Jurkat细胞组CD59与CD3联合作用后细胞增殖能力、ZAP-70酪氨酸磷酸化水平以及胞内钙离子浓度均明显低于未转染组与转染空质粒组(P0.05)；但未转染组和转染空质粒组之间无差异。结论：CD59对CD3介导T细胞活化信号转导有增强效应。目的：采用RNAi技术构建并筛选携带针对CD3ξ基因的pSUPER-RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞克隆。方法：应用DNA重组技术,设计三条60bp可转录生成靶向CD3ξ小发卡RNA (shRNA)的寡核苷酸序列,并以pSUPER.retro.neo+gfp质粒作为空载体,经过限制性核酸内切酶酶切后与设计序列进行重组,以构建CD3ζ pSUPER-RNAi逆转录病毒载体,用脂质体法转染包装细胞系PA317,建立产生逆转录病毒的细胞克隆。结果：重组载体经过限制性核酸内切酶酶切、PCR和基因测序鉴定证实CD3ζ pSUPER-RNAi重组质粒构建成功；脂质体法把重组载体转染包装细胞系PA317,镜下观察可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。结论：本实验成功地构建了特异性沉默CD3ξ基因的pSUPER-RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系,为后续研究CD59与CD3ξ在T细胞内信号转导的相互作用提供理论和实验依据。目的：将前期构建好的pSUPER-CD3ζNAi与pSUPER-CD59RNAi真核表达载体于Jurkat细胞中稳定表达,研究CD59与CD3分子在T细胞活化信号转导通路中的相互作用,从而探讨CD59向T细胞内传递信号的相关机制。方法：收集病毒上清,然后感染Jurkat细胞,经过G418压力筛选建立稳定转染的细胞系,利用RT-PCR检测转染后CD3ξ在mRNA水平的表达抑制效果；利用噻唑蓝(MTT)比色法检测转染重组载体前后各组Jurkat细胞的增殖效应；采用Western Blot技术检测各组Jurkat细胞的ZAP-70酪氨酸磷酸化的水平；利用激光共聚焦显微镜检测各组细胞胞浆内Ca2+的变化；应用ELISA检测细胞上清中白介素2(IL-2)的变化水平,比较各组差异。结果：RT-PCR结果表明重组载体转染后CD3ξ基因表达受抑制,且3条干扰序列中有2条可以明显抑制CD3ξ基因的表达(siCD3ζ-R2and siCD3ζ-R3),其中siCD3ζ-R2和siCD3ζ-R3组mRNA的表达分别降低到42.71%(P0.01)和47.52%(P0.01)。转染干扰质粒的细胞组在联合作用后其细胞增殖能力,ZAP-70酪氨酸磷酸化水平,钙离子浓度及IL-2变化均明显低于未转染组与空质粒组,其差别有统计学意义(P0.05),并且转染CD3ζNAi质粒组低于转染CD59RNAi质粒组,两组细胞比较其差别有统计学意义(P0.05) 结论：CD59和CD3在T细胞活化信号转导中存在协同作用,且CD59可借助CD3ξ向胞内传递信号。
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【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.11

【参考文献】