β-arrestin2在压力超负荷激活AT1受体致心室重构中的分子机制研究

发布时间：2018-03-22 19:43

本文选题：β-arrestin2　切入点：血管紧张素Ⅱ受体　出处：《复旦大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肾素-血管紧张素(RAS)系统是体内重要的调节压力和容量负荷的信号轴,作为终端压力感受器之一的血管紧张素Ⅱ—型受体(AT1-R)成为近年来的研究热点,尤其是AT1-R在代偿性的心室重构所导致的心脏肥大和心力衰竭中发挥重要作用。临床研究显示,许多血管紧张素受体拮抗剂(ARB)类药物在血压控制方面要优于血管紧张素酶抑制剂(ACEI)类药物。我们早期的实验结果也发现,AT1-R可以不依赖于AngⅡ而独立活化。例如,采用机械牵张(力学负荷)而不依赖于AngⅡ的方法,可以诱导体外培养心肌细胞产生肥厚现象；应用升主动脉缩窄(TAC)方法构建压力超负荷模型,也可诱发血管紧张素原基因敲除(ATG-/-)小鼠心室重构及心力衰竭的发生。这种独立于AngⅡ的AT1受体活化形式以及所介导的细胞内信号通路目前尚不明确。然而,有越来越多的证据表明,机械应力引起的G蛋白偶联受体(GPCRs)活化,并不通过经典的G蛋白信号转导途径。故此,我们推测AT1-R作为G蛋白偶联受体超家族的一员,其受体跨膜蛋白上可能存在机械应力感受位点,在机械牵张的过程中这些位点被活化,从而导致AT1-R构象发生相应改变而被激活。而且,通过这些位点活化的AT1-R,可能激活的是G蛋白非依赖的旁路途径,并最终改变心肌细胞的生物学性状。因为,在体外培养的心肌细胞牵张实验中,我们确实筛选到一类重要的信号支架蛋白——β-arrestin2有细胞膜招募的现象,同时在一些研究中证实,β-arrestin蛋白依赖的信号级联反应在GPCRs受体活化中非常重要,可能参与了心脏重构的过程。因此,本研究从AT1-R受体活化的感受位点着手,深入探究机械应力激活AT1-R介导的信号转导途径,以及在诱导心肌细胞生物性状改变的分子机制。从而明确压力超负荷引起的心室重构以及心力衰竭的发病机理,为临床预防和治疗压力负荷型心血管疾病提供理论依据和筛选药物靶点。第一部分：机械应力致AT1-R构象改变的作用位点和受体激活的分子机制目的：探讨机械应力激活AT1-R受体的具体感受位点和以及下游信号转导途径。方法：通过构建的不同AT1-R膜蛋白结构域(TM)的突变体与外源性FLAG标记的ERK2共转染COS7细胞,经机械牵张10分钟后,观测AT1-R活化介导的外转的磷酸化ERK1/2水平变化。同时,利用AngⅡ和机械牵张两种激活AT1-R方式分别检测受体活化介导的细胞内信号通路改变。并通过阻断G蛋白偶联途径上的关键效应分子：(1)GTP拮抗剂G0635或转染Gaq负调控基因RGS4阻断G蛋白活化；(2)利用GF109203X阻断PKC分子分别观察AngⅡ(10-7mol/L)干预和机械牵张(10%)对于下游ERK1/2活性的影响。结果：野生型AT1-R在AngⅡ和机械牵张两种刺激下都可活化ERK1/2；位于靠近AT1-R的N端TM1-3区域的突变(C76A、C121A)仅对机械牵张刺激有应答；位于中部TM4～5区域的突变(C149A、K199Q)对于AT1-R的激活没有影响,而K199Q转染COS7细胞株对于AngⅡ的应答明显减弱；位于靠近C端TM6～7区域的突变(H256A、C289A)仅对AngⅡ刺激有应答；位于C末端的突变(G303R)致机械牵张和AngⅡ的活化AT1-R的效应皆消失。同时,机械牵张介导的时间-依赖性PKC和IPx的表达明显弱于AngⅡ的作用；并且阻断了G蛋白偶联机制(Gαq或PKC)后,AngⅡ激活AT1-R细胞内信号通路被抑制；而对于机械牵张诱导ERK1/2磷酸化效应没有影响。结论：AT1-R对机械负荷刺激的感应部位靠近受体C端的TM7结构域,并通过C末端残基调节机械-化学信号转换；机械应力激活AT1-R介导的细胞内信号不依赖G蛋白偶联,而是通过G蛋白非依赖的旁路途径活化心肌细胞效应分子ERK1/2。第二部分：机械牵张活化AT1-R介导G蛋白非依赖信号通路的研究目的：阐明机械应力激活AT1-R的细胞内信号蛋白和活化ERK1/2的信号通路。方法：通过细胞免疫荧光和免疫共沉淀技术,在心肌细胞或转染AT1-R受体的HEK-293细胞,检测机械牵张后与AT1-R发生作用关系的信号支架蛋白的表达和定位,以及激活下游ERK1/2的信号机制。并且通过在体的ATG基因敲除小鼠(不表达血管紧张素原)验证该蛋白在压力超负荷刺激下的作用机制；通过心脏超声和血流动力学检测心脏形态和心脏功能,判断阻断该蛋白信号通路后对于心室重构的影响。结果：体外细胞实验显示,机械牵张10分钟后信号支架蛋白β-arrestin1/2的mRNA和蛋白水平皆没有变化,而β-arrestin2有细胞膜招募的现象。单独转染β-arrestin1或β-arrestin2对于机械牵张的效应不同,仅β-arrestin2可增强机械应力诱导磷酸化ERK1/2的表达。同时,伴随β-arrestin2的细胞膜聚集,Src激酶的水平持续增高。免疫共沉淀显示机械牵张可促进Src与β-arrestin2的结合,并且免疫荧光显示在突变β-arrestin2的催化中心结构域(V54D)后,有效阻断β-arrestin2与Src的细胞膜上聚集。利用SU6656(Src激酶抑制剂)或者β-arrestin2siRNA同样有效地抑制机械牵张引起的ERK1/2活化。体内的实验结果显示,机械应力(TAC模型)可增强ATG-/-小鼠心肌AT1-R的表达,同时组织膜蛋白中的β-arrestin2的水平也显著升高。心脏超声显示：在压力超负荷(TAC)2周,ATG-/-小鼠与C57野生型小鼠一样,心脏舒张期左心室前壁(LVAWd)和后壁(LVPWd)明显增厚;左心室射血分数代偿性增加；同时血流动力学显示主动脉血压(ABP)和左心室收缩末期压(LVESP)和左心室内压力变化速率(dp/dtmax)也相应的升高。经过SU6656预处理后,可有效逆转TAC导致增高的心脏超声和血流动力学相关指标。此外,通过SU6656抑制Src激酶后,诱导心肌肥厚的胎儿基因ANP、BNP、和SAA的mRNA水平也有明显下调,仅SERCA2a的表达出现上调,提示阻断β-arrestin2/Src信号通路可以减弱压力超负荷诱导心肌肥厚的发生。结论：β-arrestin2的细胞膜招募可有效激活Src激酶,并促进效应分子ERK1/2的磷酸化水平增高,是机械牵张活化AT1-R受体的关键信号机制。同时,血管紧张素非依赖的ATl-R活化同样可诱导心室重构的发生,通过阻断β-arrestin2/Src信号通路可改善心室重构现象。第三部分：机械应力诱导细胞膜招募β-arrestin2与AT1-R的结合部位目的：验证AT1-R的TM7结构域对细胞膜招募β-arrestin2及信号转导的重要性。方法：在COS7细胞内共转染FLAG-β-arrestin2质粒和TM7结构域(或C末端突变)的AT1受体质粒Cys289Ala和Gly303Arg,通过免疫共沉淀检测TM7-C末端区域突变对于AT1与β-arrestin2结合的影响；选用机械牵张敏感的特异性的ARBs(坎地沙坦)抑制AT1-R的激活后,测定ERK1/2磷酸化水平并与机械牵张不敏感而AngⅡ敏感的ARBs(替米沙坦)的效应比较；利用Westernblot技术检测转染Cys289Ala和Gly303Arg突变体质粒的COS7细胞的凋亡相关指标：Caspase3的活性以及Bcl-2与Bax的比例,观察阻断AT1-R的TM7～C末端的压力感应和信号传递部位后对于细胞生存的影响。结果：机械牵张后细胞膜蛋白中检测到AT1与β-arrestin2的结合在Cys289Ala和Gly303Arg转染细胞株明显减少；同时,利用坎地沙坦抑制TM7区域的构象改变后有效阻断了机械牵张引起的ERK1/2活化；而且在Cys289Ala和Gly303Arg转染COS7细胞,机械牵张引起的细胞凋亡明显增多,表现为Caspase3活性升高和Bcl-2/Bax比例下降。结论：TM7结构域的变构是机械应力激活AT1-R致机械-生物信号转换的重要特征,对于β-arrestin2的膜上招募和下游信号ERK1/2活化非常重要。突变或抑制这一部位的运动阻断了β-arrestin2信号,而激活了细胞的凋亡信号。第四部分：AT1-R介导的β-arrestin2信号在心肌纤维化中作用目的：研究机械应力激活β-arrestin2信号通路对压力超负荷下心肌纤维化的影响。方法：首先,在不表达AT1-R和高表达AT1-R的两种293细胞分别转染FLAG-β-arrestin2质粒,利用Westernblot技术检测机械牵张刺激两种细胞后TGF-β1信号效应蛋白Cofilin和LIMK的表达；其次,转染β-arrestin2突变体和使用SU6656预处理观察Src激酶对于β-arrestin2调控Cofilin/LIMK的作用；第三,通过沉默Cofilin基因检测β-arrestin2激活Cofilin对于TGF-β1信号分子(TGF-PRI、ROCK和Smad3)的调控作用。在体内利用慢病毒转染β-arrestin2shRNA敲减ATG-/-小鼠体内β-arrestin2的表达后,检测压力超负荷刺激下心肌纤维化的各项指标变化：MassonⅢ染色法测定心室肌的胶原表达量；RT-PCR测定Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA水平；Westernblot测定ROCK和Cofilin蛋白的表达。结果：β-arrestin2通过AT1-R激活依赖的方式调控Cofilin/LIMK的活性,却不依赖于Src激酶的活化；抑制Cofilin蛋白可阻断β-arrestin2对于机械应力激活TGF-β1信号的调控作用；在ATG-/-小鼠体内敲减β-arrestin2的水平可明显抑制压力超负荷下TGF-β1的信号,减缓心室肌胶原的表达和促进心肌纤维化的发生。结论：机械应力激活的AT1-R/β-arrestin2信号通路可诱导心肌肥厚的同时通过调控Cofilin/LIMK的活性来加速心肌纤维化的进程；抑制β-arrestin2对于压力超负荷介导ATG-/-小鼠心室重构具有心脏保护效应。总结： 1.不同于Angll激活AT1-R受体是通过G蛋白偶联的信号机制活化效应分子ERK1/2,机械牵张激活AT1-R受体是经G蛋白非依赖的β-arrestin2信号通路促进下游ERK1/2磷酸化。 2.AT1-R的TM7结构域是机械牵张活化受体的压力感受位点和机械-化学信号转换的关键部位。 3.AT1-R介导的β-arrestin2/Src信号途径促进压力超负荷下心肌肥厚的发生。 4. β-arrestin2以AT1-R激活依赖的方式调控Cofilin/LIMK蛋白活性,促进压力超负荷下心肌纤维化的发生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【相似文献】