基于质谱的组蛋白翻译后修饰与定量蛋白质组学方法研究

发布时间：2018-03-25 15:05

本文选题：组蛋白翻译后修饰　切入点：质谱　出处：《复旦大学》2012年博士论文

【摘要】：组蛋白翻译后修饰是当今表观遗传学的一个研究热点,其中,基于质谱对组蛋白翻译后修饰位点的鉴定和发现的研究越来越受到科研工作者的关注：同时,定量蛋白质组学作为蛋白质组学的一个重要分支,有关其新方法的研究对于推动整个蛋白质组学的发展起着举足轻重的作用。本研究工作基于质谱,建立了多种组蛋白翻译后修饰位点鉴定方法,并且可以应用到新翻译后修饰位点的发现中；另外还建立了一个体内终端氨基酸标记定量新方法,并且对实验数据的定量分析和优化进行了软件设计、编辑、测试和应用。为了使该方法的应用更加全面和广泛,对此体内终端氨基酸标记定量新方法进行了系统的改进。论文的主要内容如下： 1)概述了组蛋白的基本概念、变体类别、翻译后修饰的种类、重要生物功能以及组蛋白翻译后修饰的难点和主要解决方法,尤其是基于质谱的各种分析方法。介绍了定量蛋白质组学的发展现状,各种定量蛋白质组学的方法原理、优缺点和发展应用,一些新出现的定量蛋白质组学新方法和各种定量蛋白质组学分析软件。 2)利用浓硫酸提取细胞组蛋白的方法,实现了细胞中组蛋白的有效提取；通过在线反相色谱RPLC-高分辨LTQ-Orbitrap组蛋白分子质量测定方法,在蛋白水平上获得各种组蛋白变体和组蛋白翻译后修饰(PTMs)的分布,并且将该方法应用到多个肝癌细胞株的组蛋白分子质量比较的研究中；建立了多酶酶解和高分辨LTQ-Orbitrap质谱结合的组蛋白酶解肽段PTMs位点鉴定的方法,在获得组蛋白整体PTMs分布的前提下,实现了组蛋白酶解肽段PTMs位点的鉴定,并且在人肝癌细胞QGY-7703中组蛋白H4上发现一个新的甲基化位点R67；同时采用气泵手动上样.亲水相互作用色谱HILIC-高分辨LTQ-Orbitrap质谱结合的组蛋白酶解肽段PTMs位点鉴定的方法对人肝癌细胞QGY-7703中组蛋白H3的PTMs进行了分析以及利用MALDI质谱低分子量端特征碎片离子检测方法对一、二、三甲基化和乙酰化PTMs位点进行了探索。 3)基于目前的定量蛋白质组学方法,为解决一级质谱质量差异定量方法的复杂度高和灵敏度低的不足、相同一级质量二级质量标签定量方法的低质量端“抑制效应”难题,建立了一种体内终端氨基酸标记(IVTAL)的定量蛋白质组学新方法。该方法结合一组具有相同质量增加的重同位素标记的精氨酸13C6-Arg和赖氨酸13C6-Lys以及一组特异性内切蛋白酶Lys-N和Arg-C,经过细胞培养和酶解后,实现了通过二级质谱在整个质量范围内b,y碎片离子对峰强度来定量肽段和蛋白。相比传统的一条肽段定量仅由一个比值决定的方法,IVTAL采用多对b,y碎片离子来定量一条肽段,因此肽段的定量信息更加准确和可靠。作为一种高精度和高可靠的定量蛋白质组学方法,IVTAL适用于所有细胞培养设计的定量实验,尤其适用于一条肽段中多种翻译后修饰类型和多个翻译后修饰位点的定量研究。另外,该方法可实现蛋白定性和定量的同步性,其中的b,y碎片离子对还可以为定性分析提供更加准确的补充信息。 4)基于IVTAL方法和SEQUEST搜索引擎,以及Perl语言和Matlab软件,独立地开发了一种定量分析和优化软件Isobaric Tandem MS Quantitative (ITMSQ)。该软件主要是通过计算串级质谱中b,y碎片离子对的峰强度比值来得到肽段和蛋白的定量信息,ITMSQ适用于包括IPTL和iMSTIQ在内的所有IsobaricMS2定量方法。另外,针对IsobaricMS2定量方法中b,y碎片离子对共碎裂的串级质谱图,ITMSQ还增加了“谱图拆分”的优化模块,大大增加了IVTAL方法定性和定量的数据量,保证了定量数据的准确度和可靠性。利用IVTAL方法标记HeLa细胞的质谱数据对ITMSQ的定量和优化功能进行了成功的测试并获取IVTAL方法中变化蛋白的上、下调界限。分别考察了SEQUEST数据库搜索时b,y离子对的质量偏差和ITMSQ软件提取b,y离子时离子强度对IVTAL方法定量准确度的影响。 5)为了使IVTAL方法更加简单、方便和广泛地应用到定量蛋白质组学的研究中,本研究对IVTAL方法进行了系统的优化,结合trypsin酶解和二甲基化标记形成一个全面的IVTAL方法(G-IVTAL)。两株细胞分别采用含有正常精氨酸和赖氨酸或者重精氨酸15N4-Arg和重赖氨酸13C615N2-Lys的细胞培养基进行细胞培养,然后细胞全蛋白的trypsin酶解产物分别同氘代甲醛(CD20)或者正常甲醛(CH20)进行N端二甲基化标记反应,最后的肽段产物在一级质谱图中质量相同而在串级质谱中产生b,y碎片离子对,同样通过计算b,y碎片离子对峰的强度比,得到肽段和蛋白的定量信息。与IVTAL方法相比,G-IVTAL方法不仅保证了定量信息的准确度和可靠性,而且所有的酶解肽段都可以提供定性和定量分析,大大增加了定性和定量数据的信息。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R341

【共引文献】