血管紧张素转化酶2对于胶原及其限速亚单位P4Hα1的作用和机制研究

发布时间：2018-03-28 11:50

  本文选题：ACE2　切入点：Ang(1-7)　出处：《宁夏医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：背景 胶原是人体中细胞外基质（ECM）中主要的结构蛋白，其中I型和III型胶原蛋白是血管壁结构中最常见的胶原蛋白亚型，其分泌和降解的平衡是维持细胞外基质正常，增加动脉斑块稳定以及降低血管壁破裂的重要因素。 众所周知，4羟基-脯氨酸羟化酶（P4H）对于胶原蛋白的生物合成具有重要作用，它是一个具有两个α亚基和两个β亚基的四聚体，其中，α亚基决定其生物活性，足量的P4Hα1可以促进胶原蛋白的合成，而P4Hα1表达的降低也可相应减少胶原蛋白的含量。 在人体内，肾素-血管紧张素系统与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。其中，血管紧张素II（AngII）可以引起血管收缩，血管平滑肌细胞增殖肥大以及诱导炎症反应的产生。有关研究已经证明AngII可以抑制P4Hα1的活性和降低胶原的合成以破坏ECM的结构，，从而导致斑块的不稳定和破裂。在肾素血管紧张素系统中的另一物质血管紧张素转化酶2（ACE2），具有与AngII的反作用，可发挥很强的抗炎症反应作用，并可促进胶原的合成以及斑块的稳定，而且可将AngII水解为血管紧张素（1-7）（Ang（1-7）），后者作为AngII的内源性拮抗因子，可与AngII产生对抗作用。 目的 1.在体外实验中，观察ACE2是否可以促进P4Hα1的表达并增加胶原蛋白含量。 2.在体外实验中，研究并探讨ACE2对于P4Hα1以及胶原合成的作用机制和途径。 方法 ACE2重组腺病毒的制备 我们通过AdMax系统制备携带ACE2的重组腺病毒（AdACE2）以及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的重组腺病毒（AdEGFP）。 对细胞的预处理 我们用10-6mol/L的AngII刺激平滑肌细胞24小时。24小时候再对细胞进行分组刺激。 对细胞的刺激 我们用106pfu AdEGFP刺激细胞24小时以及用相同剂量的AdACE2刺激细胞24,48,72小时来研究ACE2对P4Hα1的作用。为了研究Ang（1-7）的作用，在时间效应实验中，我们用10-6mol/L的Ang(1-7)刺激细胞2,4,8,16,24小时；在剂量效应实验中，我们用10-5mol/L,10-6mol/L以及10-7mol/L的Ang(1-7)分别刺激细胞24小时。接下来，为了分析ACE2的作用机制，我们用Ang(1-7)的抑制剂A779来作对比，将实验分为六组，每组刺激24小时，除了ACE2为106pfu外， Ang(1-7)和A779都是10-6mol/L，具体分组为对照组， AdACE2组，AdACE2+A779组，Ang(1-7)组,Ang(1-7)+A779组和A779组。 实时定量RT-PCR 细胞刺激结束后，我们提取细胞的RNA并进行逆转录，使用实时定量RT-PCR检测P4Hα1的mRNA含量，并通过β-actin的CT值进行校准。 Western blot 我们提取经过刺激的细胞的蛋白质后，通过进行凝胶电泳，转膜，谈后标记一抗和二抗，进而曝光，最后可以观察到目的蛋白的表达。 ELISA 我们将细胞的上清液提取出来以后，使用ELISA试剂盒分析得出胶原蛋白I和III的表达含量。 结果 ACE2促进P4Hα1的表达 在时间效应实验中，我们用106pfu AdACE2分别刺激细胞24,48,72小时，通过RT-PCR我们发现24小时后，P4Hα1的表达最强烈，明显高于其他各组，到48小时时表达已降低，72小时与48小时时差别不大，但都高于对照组以及AdEGFP组。 Ang(1-7)增加P4Hα1的表达 对于Ang(1-7)对P4Hα1的作用效果，在时间效应实验中，我们用10-6mol/L的Ang(1-7)刺激细胞2,4,8,16,24小时，发现其效果随时间逐步上升并在24小时时达到最高且明显高于对照组；在剂量效应实验中，我们用10-5mol/L,10-6mol/L以及10-7mol/L的Ang(1-7)分别刺激细胞24小时，结果显示，其作用效果随浓度的上升而上升，在其后的实验中，我们选取10-6mol/L作为Ang(1-7)的作用浓度。 A779抑制ACE2和Ang（1-7）对于P4Hα1的作用 为了研究ACE2对于P4Hα1的作用机制，我们除了用AdACE2和Ang(1-7)刺激细胞外，还使用了Ang(1-7)的抑制剂A779与两者混合刺激。根据RT-PCR以及Western的结果，单纯Ang(1-7)的刺激要比单纯ACE2的刺激作用大的多，加入抑制剂后，A779可以几乎全部抑制Ang(1-7)的作用但是只是部分抑制了ACE2，单纯的A779刺激使得P4Hα1表达比对照组更低。说明ACE2对P4Hα1的作用途径是通过对AngII的降解来提高Ang(1-7)，而Ang(1-7)是直接产生促进作用。 ACE2提高胶原蛋白的含量 通过ELISA分析，胶原蛋白I和III的含量在ACE2和Ang(1-7)刺激下明显升高，且前者高于后者。A779加入后，ACE2的作用大约60%被抑制，而Ang(1-7)的作用基本上全部被抑制。 结论 1. ACE2可以促进P4Hα1的表达以及增加胶原蛋白的含量。 2. ACE2对于P4Hα1和胶原的作用途径可以分为两部分，一方面水解AngII,可减少其对P4Hα1和胶原的抑制作用；另一方面通过水解AngII增加Ang(1-7)的含量，提高P4Hα1表达和胶原合成。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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本文编号：1676202