人脐带间充质干细胞协同脂肪颗粒移植的实验研究

发布时间：2018-03-30 01:32

  本文选题：人脐带间充质干细胞　切入点：诱导　出处：《河北医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的：本研究在体外特定条件下，诱导人脐带间充质干细胞(humanumhilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)向脂肪细胞定向分化，并将诱导后具有脂肪细胞表型的hUC-MSCs混合脂肪颗粒移植于裸鼠腹部筋膜下，研究其在脂肪移植中促进血管再生及向脂肪细胞分化能力，为人脐带间充质干细胞在脂肪移植中的应用奠定理论基础。 方法：无菌条件下取得足月妊娠分娩新生儿脐带，用剪刀剪切成约4cm的脐带组织段，将其用无菌生理盐水冲洗干净以去除脐带中残留的血液。齿镊祛除一条脐静脉和两条脐动脉，避免血管内皮细胞污染组织，将脐带中华通胶组织（Wharton’s Jelly）撕裂成条索状，将其剪成大小约1mm3的组织块，将华通胶组织块置于培养瓶中培养，得到hUC-MSCs，应用流式细胞术测定其表面抗原表达情况；合用浓度为1.0×10-6mol/L地塞米松、0.5mmol/L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、10mg/L胰岛素、0.2mmol/L吲哚美辛这四种成脂诱导剂定向诱导hUC-MSCs向脂肪细胞分化，观察细胞分化情况并利用油红-O免疫组化染色鉴定细胞的分化情况；取成年雄性SD大鼠肠系膜及腹股沟处脂肪,制备成体积约为0.5~1mm3的脂肪颗粒，免疫组织化学染色及扫描电镜观察切取的脂肪组织与剪碎离心的脂肪颗粒其细胞形态结构、组织中血管形态及大血管含量；雄性裸鼠30只，随机分为7天、14天、28天三组，采用同体对照的方法，左侧为实验侧，右侧为对照侧，将3组又分为7天实验组、7天对照组、14天实验组、14天对照组、28天实验组、28天对照组；用终浓度为10μmol/L的BrdU标定的hUC-MSCs向脂肪细胞诱导后，将具有脂肪细胞表型的hUC-MSCs混合脂肪颗粒注射移植至裸鼠左侧腹部筋膜下，相同剂量的单纯脂肪颗粒注射至裸鼠右侧腹部筋膜下；移植后7天、14天、28天时取出移植的脂肪组织称重，分析同一时期实验组与对照组两组之间脂肪重量差别；组织学观察：将取出的脂肪组织进行组织切片HE染色，对移植的脂肪组织结构、细胞形态及微血管含量进行观察；免疫组化染色：利用内皮细胞特异性标记CD34抗体,免疫组化法显示微血管,将不同时期脂肪移植体按照周边区及中央区划分,对各组微血管含量进行定量研究。实验组中利用BrdU抗体，检测经BrdU抗原标记的具有脂肪细胞表型的干细胞是否存在，已确定移植的干细胞是否成活，并向脂肪细胞分化。 结果： 1实验室前期鉴定结果证实：流式细胞技术检测细胞阳性表达干细胞表面标记CD29、CD44、CD105，而造血干细胞表面标记CD14、CD34、CD45表达呈阴性，证明培养获得的细胞为纯化的间充质干细胞。 2联合应用地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素和吲哚美辛时诱导hUC-MSCs生成脂肪细胞的转化率高达90％以上，油红-O染色阳性,证明干细胞向脂肪细胞分化。 3hUC-MSCs对颗粒脂肪组织移植后重量变化的影响：移植400mg颗粒脂肪组织于裸鼠腹部筋膜下,移植7天、14天、28天后实验组移植物平均重量分别为(399.22±5.43)mg、(380.79±7.30)mg、(362.53±9.48)mg，重量维持率分别为99.8%、95.19%、90.63%。在同样观察时间内,对照组平均重量分别为(277.05±6.33)mg、(230.55±9.28)mg、(202.37±7.73)mg,重量维持率分别为69.29%、57.64%、50.59%。统计结果显示，在相同观察时间内,实验组和对照组比较差异有显著性意义(P 0.01)。 4移植物微血管观察：分别于各时期周边区和中央区取4个高倍视野，计数出每个视野微血管量。染成棕色单个内皮细胞、内皮细胞簇均视为1个血管计数单位，计算每平方毫米面积内微血管含量，求其均值。中央区血管密度在7天，14天，28天时，实验组分别为29.44±3.86个，45.74±5.07个，60.79±7.36个，对照组分别为16.83±3.13个，32.01±5.23个，44.04±6.10个。周围区血管密度在7天，14天，28天时实验组分别为65.10±4.18个，89.55±6.37个，73.30±6.33个，对照组分别为47.32±5.63个，71.47±5.51个，53.42±5.96个。利用SPSS13.0统计软件进行统计分析。同一时期实验组与对照组中央区血管密度的比较，7天组（P＜0.01），14天组（P＜0.01），28天组（P＜0.01），同一时期实验组与对照组周围区血管密度比较7天组（P＜0.01），14天组（P＜0.01），28天组（P＜0.01）,说明同一时期无论中央区还是周边区血管密度实验组都要大于对照组；同一时期实验组中央区与周围区血管密度比较7天组（P＜0.01），14天组（P＜0.01），28天组（P＜0.01），同一时期对照组中央区与周围区血管密度比较7天组（P＜0.01），14天组（P＜0.01），28天组（P＜0.01），说明同一时期无论是实验组还是对照组周围区血管密度要高于中央区血管密度。3个时期实验组中央区血管密度比较（P＜0.01），，周围区血管密度比较（P＜0.01），对照组3个时期中央区血管密度比较（P＜0.01），周围区血管密度比较（P＜0.01），说明实验组与对照组3个时期周围区与中央区血管数目差异都具有统计意义。从上述结果我们可以得出：随着时间的增加，无论实验组还是对照组周边区血管密度在14天达到最高峰，28天组要高于14天组，而中央区血管密度随着时间逐渐增加。 5免疫组织化学染色检测到经BrdU标定核被染成棕色的阳性脂肪细胞，证明移植干细胞在体内已成活，并已长成成熟脂肪细胞。 结论： 1体外诱导的具有脂肪细胞表型的人脐带间充质干细胞混合脂肪颗粒移植后，部分干细胞转化为成熟脂肪细胞，形成受区正常的、有生命力的脂肪组织。 2移植的人脐带间充质干细胞可能通过旁分泌的方式分泌促血管形成因子，加速移植脂肪的新生血管形成，使移植的脂肪组织快速成活，提高移植脂肪成活率。 3人脐带间充质干细胞帮助形成血管，而血管的形成又促进移植脂肪的生长。 4人脐带间充质干细胞能产生新生代脂肪细胞，现有的脂肪细胞凋亡后，新生的脂肪细胞会代之成为有活力、持续、源源不断的生力军。 本实验证实人脐带间充质干细胞作为种子细胞，在脂肪移植过程中发挥重要的作用。
[Abstract]:Objective: To study the in vitro specific conditions, induced by human umbilical cord mesenchymal stem cells (humanumhilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs) and differentiated to adipocyte cells, and induced with fat cell phenotype of hUC-MSCs mixed fat granule transplantation in nude mice abdominal fascia, the research in fat transplantation to promote neovascularization and to the differentiation of adipose cells, which lays the theoretical foundation for the application of human umbilical cord mesenchymal stem cells in fat transplantation.
Methods: under sterile conditions to obtain full-term newborn umbilical cord, umbilical cord segment with scissors cutting into 4cm, the sterile saline rinse to remove residual blood in umbilical cord. The tooth forceps removed a umbilical vein and two umbilical artery endothelial cells, to avoid pollution, will pass the rubber cord the organization (Wharton 's Jelly) tear into cords will cut its tissue block size is about 1mm3, the Huatong Rubber Organization block on the culture flask, hUC-MSCs, determination of the expression of surface antigens by flow cytometry; combined with concentration of 1 * 10-6mol/L 0.5mmol/L1- -3- dexamethasone, methyl isobutyl xanthine. 10mg/L 0.2mmol/L these four kinds of insulin, indomethacin induced adipogenic differentiation into adipocytes induced by hUC-MSCs agent oriented differentiation of cells was observed by oil red -O and immunohistochemical staining of cell differentiation ; adult male SD rat mesenteric and inguinal fat, preparation of fat particle volume is about 0.5~1mm3, cut the fat tissue and cut the fat particles in the centrifugal cell morphology observed by immunohistochemical staining and scanning electron microscope, vascular morphology and vascular tissue content in male; 30 nude mice were randomly divided into 7 days, 14 days, 28 days in three groups, with body control, on the left side as the experimental side, the right side of the control side, the 3 groups were divided into experimental group of 7 days, 7 days in the control group, experimental group of 14 days, 14 days in control group, experimental group of 28 days, 28 days in control group; with the final concentration of 10 mol/L BrdU hUC-MSCs calibration to fat cells after induction of hUC-MSCs mixed fat injection into nude mice with left abdominal fascia fat cell phenotype under the same dose of pure fat particles injected into nude mice right wall after transplantation; 7 Day, 14 days, remove the transplantation of adipose tissue weighing 28 days, the analysis of the experimental group and the control group during the same period between two groups of fat weight difference; histological observation: the removal of the adipose tissue HE staining of adipose tissue transplantation and the structure, micro morphology of blood cells were observed by tube; histochemical staining: the endothelial cell specific marker CD34 antibody, immunohistochemistry showed the microvessels, the fat graft according to different periods of peripheral zone and central division, quantitative study of the microvascular in every group. Using BrdU antibody in experimental group, detected by BrdU antigen labeled with fat cell phenotype of stem cells there have been determined whether the transplanted stem cells survived and differentiated into adipocytes.
Result锛

本文编号：1683776