紫杉醇单克隆抗体的制备与应用

发布时间：2018-04-01 16:14

本文选题：紫杉醇　切入点：单克隆抗体　出处：《南方医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：1975年两位生物分子学家Kohler和Milstein利用经过免疫的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,建立了能分泌针对特定抗原产生抗体的杂交瘤细胞株,标志着单克隆抗体技术的诞生。所谓单克隆抗体(简称单抗),是指由单个B细胞克隆化所分泌的只识别一个抗原决定簇的完全均一抗体。单克隆抗体的问世,既带动了免疫学领域的一次革命,又对生物医学等多种学科的发展产生了重大影响。技术单克隆抗体的制备方法分为杂交瘤技术和基因工程技术。杂交瘤技术是目前使用最广泛的抗体制备方式,该法主要包括动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选三个环节,制备出的抗体具有高亲和力、高灵敏度、可大规模成产等优点,广泛用于物质的检测、分离工作。基因工程抗体技术种类很多,包括嵌合抗体技术、重构抗体技术、噬菌体展示技术、核糖体展示技术、基因工程小鼠制备抗体技术等。随着科学技术的发展,单抗已经在众多领域中得到了应用。单抗应用最多的领域是临床疾病的诊断,其在淋巴细胞鉴别、病原体鉴定、寄生虫检测、肿瘤诊断和分型、激素检测方面有着独特优势。人源化单抗可用于临床治疗,其在自身免疫性疾病、心血管疾病、癌症等疾病的治疗上得到了广泛应用。此外,单抗还可应用于食品中有害物质的检测,生药研究中的小分子活性成分的检测、分离、纯化及与毒性物质的中和。免疫分析法是单克隆抗体应用中一项非常重要的领域。它是基于抗原与抗体的特异性反应,同时采取酶或其他有色或发光物质标记抗原或抗体从而进行定性或定量检测,其特异性和灵敏度要远高于一般的理化方法。目前应用较多的免疫分析法是酶联免疫吸附试验(ELISA),包含双抗夹心法、间接法、竞争法三种常用的方法。它具有特异性强、灵敏度高、操作简便、样品前处理要求低、检测迅速高效、无环境污染、设备投入低等优点,适合推广应用。生药活性物质一般属于半抗原,需要在半抗原上偶联特定的大分子物质作为载体才能构成完全抗原,刺激机体发生特异性免疫应答,产生特异性抗体。与半抗原偶联的载体一般为蛋白质,如牛血清蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、钥匙孔戚血蓝蛋白(KLH),也有其他大分子物质,如多聚赖氨酸(PLL)。紫杉醇是从红豆杉属植物中分离出来的一种三环二萜化合物,具有独特的诱导微管蛋白聚合而抑制细胞分裂的抗肿瘤机制。紫杉醇在1992年被美国食品与药物管理局(FAD)批准作为抗晚期癌症的新药上市,到目前为止仍然是治疗乳腺癌、子宫癌、卵巢癌等癌症的临床一线用药。由于紫杉醇的市场需求量不断增大,其成产的主要原料红豆杉又属于稀缺资源,再加上它在植物中的含量极低,因此紫杉醇医疗价值和研究价值有着很大的上升潜力。准确高效的检测方法是紫杉醇研究中必不可少的。当前用于紫杉醇检测的方法有薄层色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、超临界流体色谱法,质谱法,生物化学方法,其中应用最广泛的方法是高效液相色谱法。这些方法尽管有些具有某方面的优势,但总体上存在着设备投入高、操作复杂、样品前处理复杂、时间消耗长等缺点,而免疫检测技术在许多天然药物的质量控制中已经得到了应用,并显示出其灵敏度高,设备投入低,方便快捷等方面的优势,因此,本研究尝试利用免疫检测技术用于紫杉醇物质的检测。本研究报道的是一种紫杉醇单克隆抗体的制备及应用该单抗建立用于紫杉醇检测的间接竞争ELISA方法。该方法适合用于有关紫杉醇的质量控制和若干研究,且在某些方面优于以往报道的紫杉醇免疫检测法。紫杉醇是小分子物质(Mr=853.93),属于半抗原,并且由于紫杉醇分子上缺少能与载体蛋白结合的基团,我们采用7-木糖基紫杉醇与牛血清白蛋白(BSA)合成抗原复合物,利用基质辅助激光飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)检测木糖基紫杉醇-BSA抗原复合物中半抗原的数目。用此抗原复合物对2只BALB/c雌性小鼠进行免疫,免疫过程中对小鼠的抗血清进行效价测定与抗体特异性测定。选择抗血清效价较高的免疫小鼠,取其脾脏细胞与SP2/0瘤细胞株融合,使用有限稀释法筛选阳性杂交瘤细胞系,通过小鼠腹腔接种法进行单克隆抗体的大量生产,利用盐析法结合proteinG层析柱纯化抗体。获得的单抗命名为3A3,该抗体类型为IgG1并且带有K轻链,对紫杉醇有很强的亲和力,与其他天然的紫杉烷类交叉反应分别为：7-木糖基紫杉醇,31.8%；三尖杉宁碱,6.17%；巴卡亭Ⅲ、10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ、1-羟基巴卡亭Ⅰ、13-乙酰-9-氢巴卡亭Ⅲ和1-乙酰氧基-5-去乙酰基-巴卡亭I,0.11%)。使用该抗体建立了用于紫杉醇检测的间接竞争ELISA,检测限是0.0098-0.3125μg/mL,并将此法应用于红豆杉的树皮、根、枝叶样品的检测。红豆杉样品检测方法的回收率是92%-94.8%,板内和板间检测的变异分别是3.6%和4.7%,该间接竞争ELISA为多种不同目的的紫杉醇检测提供了一个很有价值的方法。我们建立的用于检测紫杉醇的间接竞争ELISA比HPLC更具有实用性,即不需要高端仪器,在常规实验室条件下就可操作。使用该方法可同时检测多个样本,且样品不需要复杂前处理,有机溶剂使用极少,显示出了其低成本、高效率、操作简便性、环保等方面的优势。制备紫杉醇免疫复合物采用的紫杉醇衍生物是7-木糖基紫杉醇,这比以往报道的方法要简单得多,因为7-木糖基紫杉醇是天然的紫杉醇衍生物,可直接从市场购买,省去了紫杉醇衍生物合成过程,使得紫杉醇完全抗原合成程序更加方便快捷。从本研究获得的单抗3A3与缺少C-13侧链的巴卡亭类紫杉烷无交叉反应,从该交叉反应特性来看,推测单抗的抗原决定簇位于C-13侧链的远侧。这在一定程度上解决了现有紫杉醇免疫检测方法中的缺陷。该免疫检测法能应用于紫杉醇药物的大批量快速检测、监测体液中紫杉醇的代谢、检测极低紫杉醇含量的样品、寻找能产生紫杉醇的新资源等多方面的工作。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【参考文献】