重组杆状病毒介导甲型H1N1流感基因工程疫苗研究
本文选题：甲型H1N1流感病毒 切入点：重组杆状病毒 出处：《华中农业大学》2011年硕士论文
【摘要】：流感是一种急性的经呼吸道传染的疾病,无论是对动物养殖业还是人类健康均造成严重的危害。2009年4月,墨西哥、美国等国家相继爆发了猪源甲型H1N1流感的疫情,之后迅速蔓延至全球范围内的许多国家和地区。同年6月,世界卫生组织将此次流感流行的预警级别提升至6级。针对如此大的疫情,疫苗接种是预防和控制流感流行最有效的方法,流感病毒灭活疫苗是目前用于预防流感最为广泛的疫苗。尽管灭活疫苗保护率较好,但仍存在着不足,如制备周期较长、需要大量鸡胚,另外少数个体在疫苗接种后会产生不良反应。因此,科研工作者一直在试图研制一种更安全、更高效的流感疫苗。 杆状病毒一直被用于在昆虫细胞中表达外源蛋白。最近的研究报道,表明杆状病毒载体在真核生物启动子的驱动下可以转导不同类型的哺乳动物细胞并表达外源基因,同样基因在不同启动子的控制下,其表达水平也会有很大的差异,且经水泡性口膜炎病毒G蛋白(VSV/G)修饰的杆状病毒,其宿主范围更广,在哺乳动物细胞中的转导效率更高。 鉴于此,本研究对甲型H1N1流感基因工程疫苗进行新的探索,构建了两种启动子驱动甲型H1N1流感免疫原性蛋白表达的重组杆状病毒疫苗,并在小鼠模型上对所构建的疫苗进行免疫效力评价,主要研究内容如下： 1重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA的构建 利用对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的iel启动子和人巨细胞病毒的CMV启动子分别构建了囊膜表面展示有VSV-G蛋白重组杆状病毒,两种启动子驱动的重组杆状病毒都介导甲型H1N1流感新型基因工程疫苗BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA。 2多克隆抗体的制备和重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-HA/M1/NA的体外表达分析 在HA序列的基础上,设计引物扩增HA的亚基(tHA1),用基因工程方法,构建原核表达质粒pET28a-tHA1,将原核表达质粒pET28a-tHA1转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,通过IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白tHA1进行SDS-PAGE电泳,将目的蛋白从蛋白胶上割下,称量,用研钵研磨至糊状后在小鼠背部多点皮下注射,注射剂量为200uL。间隔两周,再次同上方法注射,后每周加强免疫一次,并每周采血检测抗体,至抗体符合要求时,即对小鼠进行眼眶采血大量收集血清,即为鼠源多克隆抗体。 为证实重组杆状病毒在体内能否有效表达外源蛋白,将重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA转导BHK-21细胞,IFA试验表明,重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA均能够在体外表达外源蛋白。 3重组杆状病毒BV-CMV-HA/Ml/NA和BV-iel-HA/Ml/NA在小鼠体内诱导的免疫原性评价 为探讨重组杆状病毒疫苗的免疫效果,以1×109PFU/只的剂量免疫BLAB/c小鼠,同时用甲型H1N1流感病毒灭活疫苗做对照。结果表明：在细胞免疫方面,两种重组杆状病毒均产生了较好的体液免疫水平,另外灭活疫苗也产生了较好的体液免疫水平。在细胞免疫方面,检测了IFN-y的转录和蛋白表达水平,实验结果表明,重组杆状病毒疫苗诱导了较好的细胞免疫,灭活疫苗诱导的细胞免疫水平相对于重组杆状病毒疫苗组则较低。 4鼠肺适应甲型H1N1流感病毒株的制备和重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-HA/Ml/NA在小鼠体内诱发的保护性免疫 用乙醚将小鼠麻醉,将甲型H1N1流感病毒(A/wuhan/10/2010)在小鼠肺脏中传代,使之成为能致死小鼠的鼠肺适应甲型H1N1流感病毒株。 攻毒结果进一步表明,重组杆状病毒疫苗和灭活疫苗在小鼠体内诱导的免疫反应均能有效抵抗致死剂量的甲型H1N1流感病毒的攻击。为发展安全有效的甲型H1N1流感疫苗奠定了基础。
[Abstract]:Influenza is an acute respiratory tract infections by disease, either for animal breeding or human health hazards caused by the severity of.2009 in April, in Mexico, have the swine H1N1 influenza outbreak in the United States and other countries, then quickly spread to the world in many countries and regions. In June of the same year, the WHO will the influenza pandemic alert level upgrade to 6. For such a large outbreak, vaccination is the most effective prevention and control of influenza, inactivated influenza virus vaccine is currently the most widely used for the prevention of influenza vaccine. Although the vaccine protection rate is better, but there are still some deficiencies, such as preparation a longer period, need a lot of chicken, a few individuals will have adverse reactions after vaccination. Therefore, researchers have been trying to develop a safer, more efficient flu vaccine.
Baculovirus has been used for the expression of exogenous proteins in insect cells. Recent studies show that, baculovirus vectors can transduce different types of mammalian cells and expression of exogenous gene in eukaryotic promoter driven by the same gene in different promoter under the control of its expression level will be very different. And by the vesicular stomatitis virus G protein (VSV/G) modified baculovirus, its host range, in mammalian cells, the transduction efficiency is higher.
In view of this, this study was to explore new influenza H1N1 genetic engineering vaccine, and constructs two kinds of promoter driven expression of recombinant baculovirus vaccine immunogenicity protein H1N1 influenza immunization, and immunogenicity evaluation of the vaccine in a mouse model, the main research contents are as follows:
1 construction of recombinant baculovirus BV-CMV-HA/M1/NA and BV-ie1-HA/M1/NA
White spot syndrome virus using (white spot syndrome virus, WSSV) of the IEL promoter and CMV promoter CMV were constructed with membrane surface display of recombinant VSV-G protein of baculovirus recombinant baculovirus driven two promoter are mediated by influenza a H1N1 influenza vaccine BV-CMV-HA/M1/NA and BV-ie1-HA/M1/NA.
More than 2 clone antibody preparation and recombinant baculovirus BV-CMV-HA/M1/NA, BV-ie1-HA/M1/NA expression in vitro
Based on the sequence of HA, primers were designed to amplify the HA subunit (tHA1), using genetic engineering methods to construct the prokaryotic expression plasmid pET28a-tHA1, the prokaryotic expression plasmid pET28a-tHA1 was transformed into E. coli BL21 (DE3) cells induced by IPTG recombinant protein expressed as inclusion bodies. The recombinant protein tHA1 SDS-PAGE electrophoresis, the target protein from the protein gel cutting, weighing, grinding with mortar to paste in the back of mice after multiple subcutaneous injection, injection quantity is 200uL. interval of two weeks, again the same way injection, a week after a second immunization, and weekly blood test antibody, and the antibody of mice to conform to requirements. A lot of blood serum was collected for mouse polyclonal antibody.
In order to confirm whether recombinant baculovirus can effectively express foreign protein in vivo, the recombinant baculovirus BV-CMV-HA/M1/NA and BV-ie1-HA/M1/NA were transduced into BHK-21 cells. IFA test showed that recombinant baculovirus BV-CMV-HA/M1/NA and BV-ie1-HA/M1/NA could express heterologous proteins in vitro.
Immunogenicity evaluation of 3 recombinant baculovirus BV-CMV-HA/Ml/NA and BV-iel-HA/Ml/NA in mice
In order to investigate the immune effect of recombinant baculovirus vaccine, with only 1 x 109PFU/ dose BLAB/c mice were immunized with H1N1 influenza virus inactivated vaccine as control. The results showed that: in the cell immunity, two recombinant baculovirus has good humoral immunity, also inactivated vaccine produces humoral immunity good level. On cell immunity, detection of the IFN-y transcription and protein expression levels, the experimental results show that the recombinant baculovirus vaccine induced immune cells effectively, destroy cellular immunity of vaccine induced with recombinant baculovirus vaccine group was lower.
Preparation of 4 mouse lung adapted to influenza A (H1N1) influenza virus strain and recombinant baculovirus BV-CMV-HA/M1/NA, protective immunity induced by BV-ie1-HA/Ml/NA in mice
The mice were anesthetized with ethyl ether, and the influenza A (H1N1) virus was subcultured in the lungs of mice, so that it could become a rat lung adapted to influenza A virus H1N1 in a lethal way in mice. The A/wuhan/10/2010 strain was able to adapt to influenza A virus.
The attack results further showed that the immune responses induced by recombinant baculovirus vaccine and inactivated vaccine in mice could effectively resist the attack of lethal dose of influenza A (H1N1) virus, which laid the foundation for developing a safe and effective influenza a H1N1 vaccine.
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392.1;S855.3
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，本文编号：1701755
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