重组人酸性成纤维细胞生长因子—穿膜肽融合蛋白的克

发布时间：2018-04-11 04:01

本文选题：酸性成纤维细胞生长因子 + 穿膜肽　；参考：《吉林农业大学》2011年硕士论文

【摘要】：酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor, aFGF)是FGF家族的一员,具有广泛的生理药理作用,在组织和器官发育、血管发生、细胞的分化与凋亡、肿瘤发生和伤口愈合等方面发挥重要作用。然而aFGF作为生物大分子进入细胞发挥作用是通过激活其受体实现的,在没有受体存在的情况下,进入细胞发挥作用成了不可忽略的难题。因此将aFGF与穿膜肽(transcriptional activator protein, Tat)融合表达并使其进入细胞发挥作用具有一定的意义。本研究拟利用基因工程技术将aFGF_(19-154)-Tat与表达载体相连接后导入到适当的宿主细胞中,使其高效表达aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白,分离纯化获得具有促细胞增殖活性的融合蛋白,为进一步开发基因工程药物奠定基础。目的：以大肠杆菌为宿主菌,利用基因工程技术表达重组人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)-穿膜肽(Tat)融合蛋白,建立aFGF_(19-154)-Tat中试规模的发酵、纯化工艺以及体外生物学活性测定方法,为进一步开发aFGF_(19-154)-Tat融合多肽创新药物奠定基础,并为相关基因工程药物提供实验依据。方法：从人胚胎肺成纤维细胞中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得aFGF的cDNA,并以aFGF的cDNA为模板,使用含有Tat片段的引物扩增出aFGF_(19-154)-Tat目的基因。将aFGF_(19-154)-Tat片段连接到原核表达载体pET3c中,构建重组原核表达质粒pET3c-aFGF_(19-154)-Tat,表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中,IPTG诱导表达,筛选高效表达的工程菌。工程菌的摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵,通过阳离子交换(CM-Sepharose FF)层析、肝素亲和层析(Heparin-Sepharose CL-6B)和凝胶排阻层析(Sephadex G-50)方法分离纯化目的蛋白aFGF_(19-154)-Tat。Western blotting和高效液相色谱分析纯化的aFGF-Tat融合蛋白,MTT法体外检测aFGF-Tat融合蛋白对NIH 3T3细胞的促增殖作用。结果:DNA测序结果证实成功构建pET3c-aFGF_(19-154)-Tat重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白。优化表达条件：37℃条件下培养,当A600为08时加入终浓度为0.8mmM的IPTG诱导4h,表达量达15%以上。高密度发酵结果显示,每升发酵液可获得菌体90g。菌体超声破碎,经SDS-PAGE证实其相对分子质量与理论预期值相符,并且是可溶性表达,通过阳离子交换层析、肝素亲和层析和凝胶排阻层析纯化,获得aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白,高效液相色谱分析显示融合蛋白纯度高于95%。Western blotting分析表明表达产物与人aFGF多克隆抗体具有特异结合能力。MTT法体外检测证实融合蛋白具有促进NIH 3T3细胞增殖作用,这与阳性对照组aFGF的生物学活性基本相同并显著高于空白对照组(P0.01)。结论：成功构建表达质粒pET3c-aFGF_(19-154)-Tat,并得到重组人aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白工程菌,发酵纯化获得aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白,体外试验证实了aFGF1g-154-Tat融合蛋白具有促细胞增殖活性,这对日后研究治疗损伤修复类药物提供了实验依据。
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【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R346

【参考文献】