福氏2a志贺氏菌waaI和rfbA功能的研究

发布时间：2018-04-11 15:15

  本文选题：福氏志贺氏菌2a + waaI　； 参考：《南昌大学》2012年硕士论文

【摘要】：志贺氏菌属(Shigella Spp.)是引起人类细菌性痢疾的病原菌,通过Ⅲ型系统分泌蛋白至人类细胞中,导致炎症应答。痢疾是一种世界范围内高发病率的肠道传染病,据保守估计,每年导致全世界死亡人数超过一百万例。 目前痢疾的主要治疗方式是抗生素疗法,并导致高达95%的临床分离株对多种抗生素有耐药性。抗生素滥用引起的细菌抗药性已成为治疗痢疾感染的难题。最近,在空肠弯曲杆菌((Campylobacter jejuni)中发现了首个细菌N-糖基化(N-glycosylation)途径,其中该途径关键酶PglB的发现,对糖蛋白疫苗的研发具有里程碑式意义。 细菌N-糖基化途径与脂多糖合成相似,均在脂载体上合成寡糖链前体,寡糖链前体经翻转至周质空间后,或者由寡糖基转移酶PglB转移到其蛋白底物上,或者先经多聚化为O-PS后,再被O-抗原连接酶WaaL连接到类脂A-核心寡糖上形成LPS。利用两种途径的相似性：若缺失催化dTDP-鼠李糖合成的基因rfbA,将可以聚合形成O-PS的寡糖链前体破坏,蛋白有可能受影响而不能被糖基化；若将O-PS来代替C.jejuni中的七糖前体,将寡糖基转移酶PglB和其蛋白底物克隆到O-抗原连接酶WaaL失活的菌中,即可能获得连接有O-PS的N-连接糖蛋白。本研究利用两途径的相似性对探究志贺氏菌内潜在糖蛋白和获得针对志贺氏菌的糖-蛋白缀合物疫苗两方面展开研究。 在本文中,采用改进的λ-Red重组系统,成功构建了福式2a志贺氏菌301waaⅠ缺失突变株和rfbA缺失突变株,同时利用低拷贝质粒成功构建了waaⅠ回复株。对这三个菌株和野生株进行LPS银染实验进行表型鉴定,发现缺失waaⅠ和rfbA,均影响了LPS合成,在凝胶中未形成一长串的梯状条带。接着,对所构建的菌株进行生理生化特征研究,并进行豚鼠角膜实验来检测毒力。结果表明：waaⅠ (?)口rfbA的缺失对菌体的生长影响不大；相比于野生株,waaⅠ突变株利用棉子糖的能力降低。在豚鼠角膜实验中,发现waaⅠ (?)口rfbA的缺失株均不能合成LPS,而影响了志贺氏菌的侵袭力,导致其不能正常侵袭豚鼠角膜的上皮细胞。随后制备了野生株和waaⅠ回复株、waaⅠ缺失突变株以及rfbA缺失突变株的全菌蛋白样品,进行双向电泳后比较野生株和缺失株的蛋白表达谱。结果发现,waaⅠ缺失株、rfbA缺失株与野生株相比有蛋白表达上调或下调的差异。随后,将acrA和pglB成功克隆至waaⅠ缺失株中,经IPTG诱导后,AcrA蛋白得到了表达,而PglB蛋白不能正常表达,但未发现AcrA蛋白糖基化。
[Abstract]:Shigella Spp.It is the pathogen that causes human bacillary dysentery. It secretes proteins into human cells through type 鈪，

本文编号：1736524