成纤维细胞生长因子23及其拮抗剂蛋白的基因克

发布时间：2018-04-11 19:32

  本文选题：重组FGF23 + SUMO融合　； 参考：《吉林大学》2012年博士论文

【摘要】：目前，，成纤维细胞生长23（FGF23）作为FGFs家族中一个重要的调磷因子及某些疾病的病理因子已成为一个特别有吸引力的治疗靶标；由于FGF23的C末端71个氨基酸（即180-251位）可与全长的FGF23竞争性结合FGFR-Klotho复合物，因此，C-末端拮抗肽用于过多的FGF23引起的低磷血症治疗具有广泛的应用前景。 为了制备具有生物学活性的可溶性重组人FGF23（rhFGF23）及其拮抗剂蛋白以满足其日益增加的药理应用需求，本研究克隆了编码227个氨基酸残基的FGF23和带有6个his标签的SUMO（小泛素相关修饰）两个基因序列，并构建了4种原核表达载体： pET3c-FGF23、pET3c SUMO-FGF23、pET22b-FGF23及pET22b-SUMO-FGF23。将构建好的四种原核表达载体分别转化到大肠杆菌Rosetta（DE3）和BL21（DE3）的宿主菌中，对FGF23表达的最佳质粒和宿主菌组合进行筛选，结果表明只有pET-SUMO-FGF23的质粒和Rosetta（DE3）宿主菌的组合具有rhFGF23蛋白表达。选取Rosetta （DE3）/pET22b-SUMO-FGF23进行目地蛋白进行最佳诱导上清条件的筛选，结果融合蛋白在16℃、0.4mM IPTG诱导19小时后上清表达量占菌体总蛋白的28％。菌体上清经DEAE离子交换及Ni-NTA亲和层析纯化、SUMO蛋白酶裂解，Western-blotting分析表明rFGF23能与其抗体产生免疫反应；进一步经MALDI-TOF/TOF分析测定后的搜库结果表明是FGF23蛋白。高效液相色谱法（HPLC）检测纯化的rFGF23纯度高于90％；SUMO-FGF23~(180-251)/Rosett（aDE3）在30℃、0.4mM IPTG诱导6小时后，融合蛋白约占菌体上清总蛋白的40％。采用人胶质瘤U251细胞测定rFGF23的生物学活性，并利用抗磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）抗体免疫印迹法检测纯化的rFGF23体外活性。采用商品化的（大肠杆菌表达）FGF23做对照，结果表明SUMO融合法得到的rFGF23引起U251细胞株ERK1/2的磷酸化水平的比值为141%，而商品化的FGF23比值为116%。后续的体内动物实验研究结果也证明了SUMO融合法制备的rFGF23能降低固定磷浓度饲料喂养的正常大鼠血液中的磷浓度，且降磷效果优于商品化的FGF23;FGF23~(180-251)的体内动物实验结果显示对内源性的FGF23产生较好的抑制效果。本研究成功的获得了表达量和活性均较高的rFGF23及FGF23~(180-251)蛋白。
[Abstract]:At present, fibroblast growth 23 FGF23 has become a particularly attractive therapeutic target as an important phosphorous regulatory factor in the FGFs family and a pathological factor for some diseases.Because 71 amino acids (180-251) of C terminal of FGF23 can compete with the full-length FGF23 to bind FGFR-Klotho complex, C- terminal antagonist peptide can be widely used in the treatment of hypophosphatemia induced by excessive FGF23.In order to prepare soluble recombinant human FGF23 (rhFGF23) with biological activity and its antagonist protein to meet its increasing demand for pharmacological applications,The four prokaryotic expression vectors were transformed into E. coli Rosetta-DE3) and BL21DE3) respectively. The best plasmid and host bacteria combination of FGF23 expression were screened. The results showed that only the plasmid of pET-SUMO-FGF23 and the combination of Rosetta-DE3) had rhFGF23 protein expression.Rosetta DE3 / pET22b-SUMO-FGF23 was selected to screen the optimal supernatant of the target protein. The results showed that the supernatant expression of the fusion protein was 28% of the total bacterial protein after 19 hours of induction with 0.4 mm IPTG at 16 鈩

本文编号：1737369