甲型流感病毒非结构蛋白NS1和人CPSF30结合的抑制剂筛选

发布时间：2018-04-16 03:20

本文选题：酵母双杂交 + 双分子荧光互补　；参考：《山西师范大学》2012年硕士论文

【摘要】：根据构建的酵母双杂交模型来筛选双黄连口服液中能抑制甲型流感非结构蛋白NS1和人切割与多聚腺苷酸化特异性因子CPSF30结合的抑制成分。首先将双黄连口服液原药设置几个浓度（v/v），分别为0.15、0.2、0.25、0.3、0.35，将其加入平板中后接上酵母双杂交模型菌，结果得出双黄连口服液对模型菌的抑制浓度为0.3。采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇将双黄连口服液分成四段—石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，根据双黄连原药的抑制浓度对其进行活性筛选，最终发现乙酸乙酯相有活性，表明乙酸乙酯相中有抑制NS1与CPSF30结合的活性物质。通过硅胶层析法将乙酸乙酯相分离，共得到20个组分。活性筛选后确定二氯甲烷与甲醇比为98:2时洗脱的组分有活性。基于黄色荧光蛋白（yellow fluorescence protein，YFP）的BiFC系统是一种较成熟的研究蛋白质与蛋白质间相互作用的方法。这种方法主要是将YFP从特定位点切开后形成两个没有荧光的C-片段和N-片段，通过一定的方法将这两个片段分别与甲型流感非结构蛋白NS1和人CPSF30蛋白结合形成融合蛋白。由于NS1和CPSF30两个蛋白间有相互作用，在其牵引下融合的两个荧光蛋白片段就会相互靠近重新组成一完整的荧光蛋白，从而在显微镜下观察显示黄绿色荧光。本实验通过构建4个中间载体来完成黄色荧光蛋白的两个片段与NS1和CPSF30的融合。最终获得包含两个融合蛋白的两个载体pGAL10CYCNS1-VN和pGAL10CYCCPSF-VC，将其通过LiAc方法同时转入酿酒酵母菌W303B中，获得重组酿酒酵母W303B[pGAL10CYCNS1-VN+pGAL10CYCCPSF-VC]。通过PCR扩增条带进一步证实了模型的准确性。经过制作玻片在荧光显微镜下对模型菌进行观察，发现酵母菌在蓝光激发下呈现黄绿色，证实了蛋白NS1和人CPSF30蛋白已经发生了相互作用；用分别加有葡萄糖和半乳糖的YPD培养基培养模型菌，在荧光显微镜下观察模型菌，蓝光激发下加有半乳糖的YPD培养基培养的模型菌呈现黄绿色荧光，而加有葡萄糖培养的模型菌无荧光出现，这说明荧光蛋白启动子是受葡萄糖抑制的。这为筛选到抑制NS1和CPSF30结合的抑制剂奠定了一定的基础。此外，为了将来构建双色或多色荧光互补模型奠定理论基础，论文对红色荧光蛋白在酵母中的表达特性作了初步的研究。根据已发表基因序列设计引物，采用连续重叠PCR方法快速克隆获得全长Dsred基因，将其与pMD-18T载体连接后进行测序鉴定。通过In-fusion方法将鉴定正确的pMD-Dsred重组载体与酿酒酵母表达载体pYeDP60进行连接，测序后利用LiAc方法将鉴定正确的pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌W303-1B中，PCR扩增筛选阳性克隆，获得的W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌经诱导培养后进行SDS-PAGE电泳分析和绿光激发荧光成像检测。PCR扩增筛选和SDS-PAGE分析显示，pYeDP60-Dsred重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中，诱导表达产物相对分子质量与预期相符，且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光。金丝桃素合酶能催化大黄素生成金丝桃素，根据已经发表的金丝桃素合成酶基因序列，设计了6对引物，通过连续重叠PCR快速克隆得到了金丝桃素合成酶基因Hyp-1。构建含Hyp-1基因的原核表达载体pET32ahyp，将该载体导入大肠杆菌进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示样品在36kDa处有条带，符合理论值的条带表明，而对照在相应位置没有条带出现，这说明Hyp-1基因在大肠杆菌中获得表达；通过Western blot检测，结果表明，与对照相比，，E.coli[pET32ahyp]经免疫印迹后，在相应的位置上出现了一条相应的杂交带。因此，确认重组的HYP-1蛋白具有特异的免疫活性，表明Hyp-1基因在E.coli中得到了表达。酶促反应经HPLC分析表明，Hyp-1确实能将大黄素催化形成金丝桃素，上述结果表明，我们克隆的Hyp-1基因确实是金丝桃素合酶基因，具备将大黄素催化形成金丝桃素的能力，从而为通过合成生物学技术来制备金丝桃素奠定了物质基础。
[Abstract]:Based on the constructed yeast two - hybrid model , the inhibitory components of non - structural protein of influenza A ( H1N1 ) and human cleavage ( CPSF30 ) can be inhibited .

Two vectors pGAL10CYCNS1 - VN and pGAL10CYCCPSF - VC were prepared by using four intermediate vectors .
Using YPD medium supplemented with glucose and galactose , the model bacteria were cultured under fluorescence microscope . The model bacteria cultured in YPD medium supplemented with galactose under the excitation of blue light showed yellow green fluorescence , whereas the model bacteria cultured with glucose showed no fluorescence , which indicates that the fluorescent protein promoter is inhibited by glucose . This lays a foundation for the selection of inhibitors to inhibit the binding of NSAs and CPSF30 .

In addition , in order to lay a theoretical basis for the future construction of two - color or multi - color fluorescence complementary model , the expression characteristics of red fluorescent protein in yeast were studied .

The expression vector pET32ahyp containing Hyp - 1 gene was constructed by continuous overlapping PCR . The results showed that the sample had bands at 36 kDa . The results showed that there was no band in the corresponding position , indicating that the Hyp - 1 gene was expressed in E . coli .
The results showed that the Hyp - 1 gene was indeed a hypericin synthase gene . The results showed that the Hyp - 1 gene was indeed a hypericin synthase gene . The results showed that the Hyp - 1 gene was indeed a hypericin synthase gene , which was capable of catalyzing emodin to form hypericin , thus providing a material basis for the preparation of hypericin by synthetic biology technique .

【学位授予单位】：山西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R373

【参考文献】