人外周血纤维细胞的分离、培养及其在真皮微血管内皮细胞作用下的趋化运动研究

发布时间：2018-04-19 09:43

  本文选题：细胞培养 + 外周血纤维细胞　； 参考：《第四军医大学》2012年硕士论文

【摘要】：外周血纤维细胞（peripheral blood fibrocytes）是近年来发现的一个多分化潜能细胞，它具有成纤维细胞的特性，并被最新研究证实能分化为肌成纤维细胞与血管周细胞。外周血纤维细胞能够在组织损伤后在炎症期迅速迁移至创面局部，进而发挥它抗原呈递、收缩创面、合成释放多种细胞因子和细胞外基质并促进创面新生血管形成等等一系列作用，因此可以说，PBFCs的定向迁移是其在创伤修复中发挥作用的重要基础。而骨髓来源的PBFCs是受到哪些因子或细胞的趋化而定向迁移到创伤部位的，关于这一问题目前尚无相关报道。此外，关于外周血纤维细胞的体外分离培养，目前常用的方法都需要免疫磁珠筛选来对PBFCs进行纯化，此法费用高昂且获得的目的细胞数量少，不利于临床应用研究的开展。 实验目的： 探索更为简便易行的外周血纤维细胞体外培养方法、了解体外培养的PBFCs生物学特征及功能，，研究体外共培养条件下人真皮微血管内皮细胞对外周血纤维细胞有无趋化作用。 方法： 采用Ficoll密度梯度离心分离法分离成人外周血，所获得的白细胞在一定条件要求下体外培养，观察不同接种密度、换液时间、血清浓度等培养条件下对PBFCs生长分化的影响，采用流式细胞技术、细胞免疫荧光染色等对体外培养的细胞进行鉴定，在扫描电镜下进一步观察其形态结构，Transwell小室共培养初步探索人真皮微血管内皮细胞对PBFCs有无趋化作用。 结果： 1．采用“密度梯度离心法”分离成人外周血得到的白膜层细胞中含有大量淋巴细胞、单核细胞和少量粒细胞，在适当的培养条件下，这些细胞于两周左右分化培养出血液来源的前体细胞——外周血纤维细胞。 2．多种因素均会对外周血纤维细胞的培养造成影响，经过我们反复实验，认为血液来源的取材、首次换液的时间、细胞的接种密度、血清浓度等均是细胞培养成败与否的关键因素。我们认为选取年龄在20至45岁的健康志愿者采血，以pH值为7.2~7.3，含有20%胎牛血清的DMEM培养基在六孔培养板上按5×106/cm2接种，4天后首次换液，之后每三天换液一次，是PBFCs培养的适宜条件，经以上条件培养得到的PBFCs细胞纯度可达80%以上，能够满足科研实验的一般要求。 3．免疫荧光染色鉴定的结果显示培养12天时CD34和COLⅠ均为强阳性表达，继续培养至28天时，血液来源的细胞表面抗原CD34发生明显丢失，免疫荧光染色几乎不能显色，相反COLⅠ持续表达阳性，显示PBFCs不断向成纤维细胞分化的特性。 4．Transwell穿膜实验证实了人真皮微血管内皮细胞对外周血纤维细胞的趋化作用，为进一步研究血管新生过程中PBFCs的定向迁移及其机制打下基础。 结论： 采用密度梯度离心法配合适当的培养条件，成人外周血中存在的前体细胞经体外分离、培养可分化为外周血纤维细胞，并保持其生物学特性，建立了较为可靠、稳定的分离培养方法。初步掌握了体外培养过程中PBFCs的生物学特性和表性变化，在此基础上，研究证实了人真皮微血管内皮细胞对外周血纤维细胞的趋化作用。
[Abstract]:Peripheral blood fibroblasts ( PBFs ) are a multi - differentiation potential cell found in recent years , which has the characteristics of fibroblasts . It has been proved to be able to differentiate into myofibroblasts and perivascular cells .

Purpose of the experiment :

Objective To explore the biological characteristics and function of cultured human dermal vascular endothelial cells ( PBEC ) in vitro and to explore the effect of human dermal vascular endothelial cells on the presence or absence of human dermal vascular endothelial cells in vitro .

Method :

Using Ficoll density gradient centrifugation method to separate adult peripheral blood , the cultured white blood cells were cultured in vitro under certain conditions , and cultured in vitro under the conditions of different inoculation density , time of change , serum concentration and so on . The cultured cells were identified by flow cytometry and immunofluorescence staining .

Results :

1 . Large amounts of lymphocytes , monocytes and a small amount of leukocytes were isolated from peripheral blood of adult by " density gradient centrifugation " . These cells were differentiated into precursor cell _ peripheral blood cells from the blood source for two weeks under appropriate culture conditions .

2 . The culture of peripheral blood cells was affected by various factors . After repeated experiments , it was concluded that the blood - derived materials , the time of the first liquid exchange , the density of inoculated cells and the serum concentration were the key factors for the success or failure of cell culture .

3 . The results of immunofluorescence staining showed that CD34 and COL 鈪

本文编号：1772575