RNAi抑制大鼠骨髓源树突状细胞MyD88基因表达的研究

发布时间：2018-04-24 14:21

  本文选题：RNA干扰 + 树突状细胞　； 参考：《天津医科大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的：应用RNAi(RNA interference)技术探讨靶向MyD88的shRNA质粒载体抑制大鼠骨髓源树突状细胞(Dendritic Cell, DC) MyD88基因表达的可行性。 方法：采用培养基选择法经体外培养大鼠骨髓源DC；流式细胞仪检测DC表面抗原MHC-Ⅱ和OX-62表达情况；经体外设计合成针对MyD88 mRNA序列特异性MyD88 shRNA3条,并分别构建于Pgenesil.1质粒,提取重组质粒进行酶切鉴定并测序；实验分为空白对照组、GenePorter 3000组、pHK-shRNA组、pMyD88 1-shRNA组、pMyD88 2-shRNA组和1pMyD88 3-shRNA组等六个组别。在阳离子脂质体转染剂介导下转染DC；荧光实时定量PCR检测转染后MyD88 mRNA表达水平的变化：WesternBlot技术检测转染后MyD88蛋白表达水平的变化。使用SPSS 17.0 for Windows进行数据分析。 结果：经体外培养,每只大鼠可获得1.0×107个DC；经测序结果分析pMyD881-shRNA、pMyD882-shRNA、pMyD883-shRNA均为插入正确的克隆质粒；荧光实时定量PCR检测显示构建的3个pMyD88-shRNA质粒通过脂质体转染大鼠骨髓源DC,均能不同程度地抑制MyD88的表达,与对照组具有显著差异(P0.01),其中pMyD88 1-shRNA质粒组的抑制作用最为明显,GenePorter 3000组与pHK-shRNA质粒对照组间MyD88的mRNA转录水平无显性差异(P0.05); WesternBlot检测显示3个MyD88-shRNA质粒组中DC转染后MyD88蛋白的的表达水平均较对照组明显降低(P0.01),与对照组有显著性差异,其中pMyD881-shRNA质粒组抑制蛋白表达作用最为明显,空白对照组、GenePorter3000组与pHK-shRNA质粒对照组间MyD88蛋白表达水平无显著性差异(P0.05)； 结论：经体外培养可收获大量大鼠骨髓源DC,形态典型。在细胞培养第12天,经流式细胞仪检测,其MHC-Ⅱ和OX-62抗原表达分别为91.36%和72.70%。与空白对照组、GenePorter 3000组与pHK-shRNA质粒对照组相比,pMyD88-shRNA质粒组可高效、特异地抑制MyD88基因的mRNA和其蛋白的表达,而其中pMyD881-shRNA质粒抑制效率更高,可用于下一步实验研究。
[Abstract]:Aim: to investigate the feasibility of inhibiting the expression of MyD88 gene in rat bone marrow-derived dendritic cells by shRNA plasmid vector targeting MyD88 using RNAi(RNA interference technique. Methods: rat bone marrow derived DCs were cultured in vitro by medium selection method, the expression of DC surface antigen MHC- 鈪，

本文编号：1797003