金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素（PVL）对THP-1巨噬细胞NF-κB信号通路及炎性因子表达的影响

发布时间：2018-04-24 17:48

本文选题：金黄色葡萄球菌 + PV-杀白细胞素　；参考：《安徽医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的： PV-杀白细胞素(Panton-Valentine Leukocidin，PVL)是由金黄色葡萄球菌产生的细胞外毒素，是主要的致病因子。PVL对人和兔的多形核白细胞(PMNs)和巨噬细胞具有高度特异性，本课题目的：1、rPVL对THP-1巨噬细胞的细胞毒性研究；2、探讨rPVL对THP-1巨噬细胞NF-κB信号通路及炎性细胞因子表达的影响。方法：（1）用不同浓度rPVL(1nM/L，5nM/L，10nM/L，20nM/L，40nM/L和80nM/L)作用THP-1巨噬细胞1，3，6h，CCK-8实验检测rPVL对THP-1巨噬细胞活力的影响。（2）5nM/L，20nM/L和40nM/LrPVL作用THP-1巨噬细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡/坏死率。（3）分别用不同浓度的rPVL (5nM/L，20nM/L)刺激THP-1巨噬细胞，于1，3，6h收集细胞培养上清，ELISA法检测细胞培养上清IL-6、IL-8和TNF-α的浓度变化。（4）20nM/LrPVL刺激细胞1，3，6h后，收集细胞，提取总RNA，应用RT-PCR法检测细胞IL-6、IL-8、TNF-α、TLR2、TLR4和CD14mRNA表达。（5）应用免疫细胞化学和Western blotting方法检测rPVL刺激THP-1巨噬细胞NF-κB的蛋白表达。（6）NF-κB阻断剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)阻断NF-κB活化，RT-PCR法和ELISA法检测其对细胞因子表达的影响。结果：（1）随着rPVL对THP-1巨噬细胞作用的浓度和时间的增加，细胞活性进行性下降。（2）rPVL作用THP-1巨噬细胞，流式细胞仪技术定量检测凋亡/坏死，在低浓度（5nM/L rPVL）以凋亡为主，在高浓度(40nM/L rPVL)以坏死为主，且具有时间依赖性。（3）ELISA法检测结果表明，rPVL能诱导THP-1巨噬细胞产生IL-8、IL-6和TNF-α，随着rPVL刺激浓度的增加和时间的延长，IL-8和IL-6表达增加；TNF-α的表达高峰在rPVL刺激1h时，随后逐渐降低。（4）免疫细胞化学方法检测结果显示：正常时，NF-κBp65蛋白在胞浆均匀分布，胞浆内呈棕色均匀淡染，rPVL刺激后2h，NF-κBp65被激活转入核内，，染色以核明显。Western blotting方法检测结果表明，rPVL能直接诱导THP-1巨噬细胞迅速活化NF-κB蛋白，具有时间和浓度依赖性。（5）NF-κB阻断剂PDTC能够阻断NF-κB信号通路，抑制IL-6和IL-8蛋白分泌和mRNA的表达。结论：（1）rPVL对THP-1巨噬细胞具有毒性作用，使细胞活力减低，低浓度可诱导细胞凋亡，高浓度可引起坏死（。2）rPVL能诱导THP-1巨噬细胞因子IL-6、IL-8及TNF-α的表达，同时，可上调TLR4表达，活化NF-κB，提示rPVL可通过TLR4/NF-κB信号传导通路，促进细胞因子的表达。（3）PDTC能抑制NF-κB通路，降低IL-6和IL-8等炎性因子的表达。
[Abstract]:Objective : To investigate the cytotoxicity of PVL on THP - 1 macrophages .
2 . To investigate the effects of rPVL on NF - 魏B signaling pathway and inflammatory cytokine expression in THP - 1 macrophages .

Methods : ( 1 ) The effects of rPVL ( 1 nM / L , 5 nM / L , 10 nM / L , 20 nM / L , 40 nM / L and 80 nM / L ) on the activity of THP - 1 macrophages were investigated .

Results : ( 1 ) With the increase of the concentration and time of rPVL on THP - 1 macrophages , the activity of cells decreased . ( 2 ) The apoptosis / necrosis of THP - 1 macrophages was detected by flow cytometry . The results showed that rPVL could induce IL - 8 , IL - 6 and TNF - 伪 in THP - 1 macrophages .
( 4 ) The results of Western blotting showed that rPVL can directly induce the activation of NF - 魏B protein in THP - 1 macrophages , which has time and concentration - dependent . ( 5 ) NF - 魏B inhibitor PDTC can block the NF - 魏B signal pathway , inhibit the secretion of IL - 6 and IL - 8 protein and the expression of mRNA .

Conclusion : ( 1 ) rPVL has a toxic effect on THP - 1 macrophages , which can induce apoptosis of THP - 1 macrophage factor IL - 6 , IL - 8 and TNF - 伪 .

【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

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