骨桥蛋白对骨髓间充质干细胞定向迁移的影响及其分子机理

发布时间：2018-04-30 02:04

  本文选题：骨髓间充质干细胞 + 骨桥蛋白　； 参考：《重庆大学》2011年硕士论文

【摘要】：骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有多向分化潜能。在不同培养条件下,MSCs能分化成为多种细胞。越来越多的证据表明,MSCs具有广阔的临床应用前景。除了易于分离获取、体外增殖潜力巨大和不涉及伦理问题这些优势外,MSCs还具有趋化特性。趋向受损部位的定向迁移已经成为MSCs临床应用研究的关键问题。 骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种细胞外基质蛋白,在不同的组织细胞中均有所发现。当机体各部位受到损伤时,损伤部位的OPN表达升高。OPN表达的升高不仅能增加多种细胞的迁移能力,同时也能介导细胞定向迁移。 迄今为止,OPN在MSCs定向迁移过程中的作用还未引起研究者的足够重视,相关的研究还鲜见报道,其分子机理更不明了。因此,本文试图揭示外源OPN在大鼠MSCs(rat MSCs, rMSCs)定向迁移过程中的作用及其分子机理。该研究工作的主要内容及结果如下: 1. rMSCs的原代分离培养及鉴定 利用1.073 g/ml的Percoll密度梯度离心法和rMSCs贴壁特性,体外分离培养rMSCs。结果表明,原代细胞14天左右达到85%融合。传代后的细胞贴壁时间约为半小时。细胞24 h内即可完全伸展,呈纤维状。传代细胞增殖能力强,4~6天达到80%~90%融合,并形成漩涡样单层,细胞形态趋于一致。流式细胞仪检测发现,分离得到的细胞表达CD44和CD90,但不表达CD34,符合MSCs表面标记抗原的一般规律。 2. OPN促rMSCs定向迁移 Transwell迁移实验检测OPN是否能够诱导rMSCs定向迁移。结果表明,OPN具有促rMSCs定向迁移的能力,并且OPN促rMSCs定向迁移的能力与OPN的浓度呈现一定的剂量相关性。 3. Integrinβ1介导OPN促rMSCs迁移 为检测在迁移过程中,OPN是否能改变细胞CD44v6或integrinβ1 mRNA的表达,RT-PCR检测OPN(1μg/ml)作用rMSCs后,mRNA的表达变化情况。结果表明,OPN能使integrinβ1 mRNA的表达水平增加(1.5倍,p0.01)。但CD44v6 mRNA的表达情况却没有明显改变。另外,western蛋白印迹表明,OPN作用2.0 h以后,integrinβ1的蛋白表达开始上升;4.0 h,达到峰值(1.3倍,p0.05);6.0 h以后,integrinβ1的蛋白表达开始下调,但依旧高于对照组。阻断integrinβ1受体后,OPN促rMSCs定向迁移的能力受到抑制。提示,OPN能够增加rMSCs中integrinβ1的表达,同时通过结合细胞表面integrinβ1受体,促进rMSCs定向迁移。 4.黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)/胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)信号通路介导OPN促rMSCs定向迁移Western蛋白印迹检测OPN(1μg/ml)作用rMSCs后,磷酸化FAK (phospho-FAK, pFAK)和磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2, pERK1/2)的表达变化情况。结果表明,OPN作用条件下0.5 h, pFAK的表达量升高(1.3倍,p0.05),FAK信号通路被激活;pERK1/2在OPN作用0.5 h时,表达升高(1.7倍,p0.05),1.0 h,达到峰值(2.8倍,p0.01),2.0 h有所回落(1.3倍,p0.05),4.0 h后与对照组相比没差异。抑制剂阻断OPN激活ERK和FAK信号通路以后,OPN促rMSCs定向迁移的能力受到抑制。另外,integrinβ1抗体可有效抑制OPN升高pFAK和pERK1/2表达的作用,阻断FAK/ERK信号通路的激活。提示,OPN结合integrinβ1受体以后,通过激活FAK/ERK信号通路,促进rMSCs定向迁移。 5. OPN改变rMSCs的力学性质 原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)检测OPN(1μg/ml)作用后,rMSCs杨氏模量的变化。结果发现,OPN可以显著降低rMSCs的杨氏模量(p0.05)。另外,阻断integrinβ1受体,抑或阻断FAK/ERK信号分子的激活均能抑制OPN降低细胞杨氏模量的作用。结果表明,rMSCs的迁移能力与其细胞硬度密切相关。 本文的研究结果表明,OPN可以通过上调integrinβ1的表达,激活FAK/ERK信号通路,降低rMSCs的细胞硬度,从而促进rMSCs定向迁移。结果提示,机体受损后,可能通过上调OPN的表达,诱导rMSCs定向迁移至受损部位,参与受损组织修复。
[Abstract]:Mesenchymal stem cells (MSCs) has multipotential differentiation potential. Under different culture conditions, MSCs can be differentiated into a variety of cells. More and more evidence shows that MSCs has a broad prospect for clinical application. Besides the advantages of easy separation and acquisition, great proliferation potential in vitro and no ethical problems, MSCs is also found. With the chemotaxis characteristics, directional migration towards damaged parts has become a key issue in the clinical application of MSCs.
Osteopontin (OPN) is an extracellular matrix protein found in various tissue cells. When the parts of the body are damaged, the increase of the expression of OPN in the injured part of the body can not only increase the migration ability of many cells, but also mediate the directed migration of cells.
So far, the role of OPN in the directional migration of MSCs has not aroused enough attention. The related research is rarely reported, and its molecular mechanism is more unknown. Therefore, this paper attempts to reveal the application and molecular mechanism of exogenous OPN in the directional migration of MSCs (rat MSCs, rMSCs) in rats. The fruit is as follows:
Primary culture and identification of 1. rMSCs
Using 1.073 g/ml Percoll density gradient centrifugation and rMSCs adherence, the results of isolation and culture of rMSCs. in vitro showed that the primary cells reached 85% fusion for about 14 days. The cell adhesion time after the passage was about half an hour. The cells could be fully extended and fibrous in the cell 24 h. The cell proliferation ability was strong, and 4~6 days reached 80%~90% fusion and formed the formation and formation of the cells. The cell morphology of the whirlpool like monolayer tends to be consistent. Flow cytometry shows that the isolated cells express CD44 and CD90, but do not express CD34, which conforms to the general rule of the MSCs surface labeled antigen.
2. OPN oriented rMSCs oriented migration
The Transwell migration test detected whether OPN could induce rMSCs oriented migration. The results showed that OPN had the ability to promote rMSCs oriented migration, and the ability of OPN to promote rMSCs oriented migration was related to the dose of OPN.
3. Integrin beta 1 mediated rMSCs migration mediated by OPN
In order to detect whether OPN could change the expression of CD44v6 or integrin beta 1 mRNA in the process of migration, the expression of mRNA was changed by OPN (1 g/ml) by RT-PCR. The results showed that OPN could increase the expression level of integrin beta 1 mRNA, but there was no obvious change in the expression of rMSCs. The blot showed that after the action of OPN 2 h, the protein expression of integrin beta 1 began to rise; 4 h, reaching the peak (1.3 times, P0.05); after 6 h, the protein expression of integrin beta 1 began to be down, but still higher than the control group. After blocking integrin beta 1, the ability of OPN promoting rMSCs to orientate migration was inhibited. It also promotes rMSCs directional migration by binding to the cell surface integrin beta 1 receptor.
4. focal adhesion kinase (FAK) / extracellular signal regulated kinase (extracellular signal)
Regulated kinase, ERK) signaling pathway mediated OPN rMSCs directed migration Western blot to detect OPN (1 u g/ml) acting rMSCs, and the expression changes of phosphorylated FAK (phospho-FAK, pFAK) and phosphorylation. The road was activated; pERK1/2 increased (1.7 times, P0.05), 1 h, reached peak value (2.8 times, P0.01), 2 h fell (1.3 times, P0.05), and 4 h compared with the control group. The inhibitor blocked OPN activation ERK and FAK signal pathways. Inhibition of OPN increases the expression of pFAK and pERK1/2 and blocks the activation of the FAK/ERK signaling pathway. It suggests that OPN promotes rMSCs directed migration by activating the FAK/ERK signaling pathway after the binding of integrin beta 1.
5. OPN changes the mechanical properties of rMSCs
Atomic force microscope (AFM) was used to detect the change of Young's modulus of rMSCs after the action of OPN (1 u g/ml). The results showed that OPN could significantly reduce the young's modulus of rMSCs (P0.05). In addition, blocking integrin beta 1 receptor, or blocking the activation of the FAK/ERK signal molecules could inhibit the reduction of Young's modulus of cells. The mobility of MSCs is closely related to its cell hardness.
The results of this study show that OPN can activate the FAK/ERK signaling pathway by up regulation of the expression of integrin beta 1 and reduce the cell hardness of rMSCs, thus promoting the directional migration of rMSCs. The results suggest that after the organism is damaged, the expression of OPN may be raised to induce the migration of rMSCs to the damaged site and participate in the repair of damaged tissues.

【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

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本文编号：1822566