PDGF-BB诱导KLF5和hhLIM协同激活血管平滑肌的增殖相关基因表达

发布时间：2018-04-29 23:33

  本文选题：PDGF-BB + KLF5　； 参考：《河北医科大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的:血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖是高血压、动脉粥样硬化和血管再狭窄等血管重塑性疾病的共同细胞病理学基础。很多生长因子与细胞因子都会引起VSMC的增殖,其中血小板衍生因子BB(PDGF-BB)具有强效的促进VSMC增殖的活性。 Krüpple样因子5(krüpple-like factor,IKLF/KLF5)是KLF家族中与胚胎发育、细胞增殖和肿瘤发生密切相关的转录调节因子。我们在前期研究中发现,在血管新生内膜的VSMC中,KLF5的表达明显增加,后者参与反式激活PDGF-A基因的转录调节。作为转录因子,KLF5能够和许多转录因子、辅转录因子发生相互作用,如RARα、c-jun、CBP, PPAR-δ、HDAC2、p300等相互作用,共同调节基因的转录。 hhLIM是LIM家族的成员之一,具有典型的LIM结构域。LIM结构域含两个锌指结构,提供蛋白结合界面从而调节蛋白与蛋白的相互作用。目前的研究发现,hhLIM作为辅激活因子,可以通过与其他转录因子相互作用的方式调节基因转录。然而,KLF5与hhLIM是否相互作用以及调节细胞增殖的具体分子机制尚不明确。 为了阐明KLF5和hhLIM在PDGF-BB调节VSMC增殖中的作用,本文在系统观察PDGF-BB对VSMC增殖活性影响的基础上,进一步探讨了KLF5和hhLIM在介导PDGF-BB促增殖中的作用和分子机制。旨在为揭示动脉粥样硬化、高血压和血管再狭窄等心血管疾病的发病机制提供新的实验和理论依据,为心血管疾病的防治提供特异性药物靶点。 方法:流式细胞光度术分析细胞周期各时相的分布情况; Western blot分析检测KLF5、hhLIM和Cyclin E达变化;免疫共沉淀检查KLF5与hhLIM之间的相互作用;报告基因分析检测KLF5和hhLIM对CyclinE因表达的影响;免疫组织化学观察整体水平KLF5、hhLIM和Cyclin E达变化。 结果: 1 PDGF-BB促进VSMC细胞周期的进程 流式细胞术分析结果显示,与对照组相比,0 ng、5 ng、10 ng、20 ng的PDGF-BB于作用VSMC后,G1期细胞数量减少,S期细胞数量增加,表明VSMC在PDGF-BB作用下增殖活性明显升高。细胞计数的结果也显示,PDGF-BB可以显著促进VSMC的增殖。上述结果提示,PDGF-BB可加快VSMC细胞周期进程,促进VSMC增殖。 2 PDGF-BB促进hhLIM的表达 用不同浓度的PDGF-BB刺激细胞24 h后,提取细胞总蛋白进行Western blot分析。Western blot结果显示,hhLIM的表达量呈剂量依赖性的增加,而KLF5的表达量没有明显的变化。提示,PDGF-BB能诱导hhLIM表达,不影响KLF5表达。 3 PDGF-BB促进KLF5与hhLIM的相互作用 提取被PDGF-BB刺激前后的VSMC总蛋白,进行免疫共沉淀。结果显示,在PDGF-BB刺激前后的VSMC中,KLF5和hhLIM均可被共沉淀,提示KLF5与hhLIM之间存在相互作用。PDGF-BB刺激后,免疫沉淀物中的KLF5和hhLIM均明显增多,说明PDGF-BB促进二者之间的相互作用。 4 KLF5与hhLIM协同促进球囊损伤诱导的血管内膜增生 为探讨KLF5和hhLIM在血管重塑中所发挥的作用,我们用腺病毒转染的方法使球囊损伤的大鼠颈总动脉过表达KLF5和hhLIM。HE染色结果,球囊损伤14天后,模型组和hhLIM过表达组内膜呈弥散性增厚,管腔缩小,内膜/中膜(I/M)比值分别为(3.33±0.26)和(3±0.26),两组之间无明显差异。而KLF5组(I/M比值4.12±0.23)与共转染KLF5与hhLIM组(I/M比值6.40±0.23)显著大于模型组和hhLIM过表达组(P0.05),提示hhLIM与KLF5协同作用促进VSMC增殖。免疫组化结果显示,正常血管内膜仅有少量PCNA表达。球囊损伤14天时,PCNA阳性染色的细胞及单细胞染色强度均较正常组显著增高。KLF5组(56±3.6%)尤其是共转染KLF5和hhLIM组(70±2.3%)PCNA阳性染色细胞数量显著高于model组(26±3.7%)和hhLIM组(33±1.7%)。上述结果提示,hhLIM协同KLF5促进球囊损伤诱导的血管内膜增生。 5 KLF5和hhLIM协同促进血管平滑肌细胞增殖和细胞周期的进程 细胞计数分析结果显示,过表达KLF5血管平滑肌的细胞数明显高于过表达hhLIM和pAd组,说明KLF5可以促进VSMC增殖。同时过表达KLF5和hhLIM细胞数(17±3×104)显著多于KLF5过表达组(14±2×104),说明hhLIM加速了KLF5促进细胞的增殖的能力。流式细胞术检测细胞周期分布结果显示,与KLF5过表达组相比,KLF5和hhLIM联合过表达组于作用VSMC 24 h后,G1期细胞数量减少,S期细胞数量增加,表明VSMC在KLF5和hhLIM联合作用下增殖活性明显升高。进一步在细胞水平上证明hhLIM与KLF5协同作用促进细胞周期的进程。 6 KLF5和hhLIM协同促进Cyclin E的表达 为进一步探讨KLF5和hhLIM促进细胞增殖的分子机制,我们检测了一系列细胞周期相关蛋白的表达水平,Western blot结果显示,过表达KLF5后CDK2,CyclinD,CyclinE的表达水平都显著升高,hhLIM过表达对上述基因表达影响不大,但是,同时过表达KLF5和hhLIM可以显著激活CyclinE的表达。上述结果表明,KLF5和hhLIM可能是通过协同促进CyclinE的表达而促进细胞的增殖。与模型组和KLF5过表达组相比,同时过表达KLF5和hhLIM组的动物模型血管组织中,CyclinE的表达显著增加。以上结果分别从细胞水平及整体水平证实,hhLIM可以与KLF5协同作用促进Cyclin E表达。 7 hhLIM通过KLF5协同激活CyclinE启动子 为探讨KLF5与hhLIM协同促进CyclinE表达的分子机制,分别将CyclinE启动子指导的报告基因质粒(Cyclin E-luc)与KLF5和/或hhLIM表达质粒共转染CHO细胞,通过双荧光素酶报告基因检测系统定量分析启动子的活性。结果显示,CHO细胞共转染KLF5和hhLIM后,启动子所激活的荧光素酶活性与KLF5转染组相比显著升高。提示,KLF5和hhLIM协同激活CyclinE基因的启动子。CylinE启动子上有两个特异的KLF5的结合位点(TCE),为进一步探明二者相互作用的分子机制,我们特异性敲低KLF5和/或hhLIM并给予PDGF-BB刺激,Oligo pull-down结果显示,特异性敲低KLF5,KLF5与TCE元件的结合明显下降;特异性的敲除hhLIM后,KLF5和CyclinE启动子区两个TCE的结合都显著降低,尤其是第一个结合位点(TCE1)。上述结果表明:hhLIM可能是通过促进KLF5与CyclinE启动子区的第一个TCE元件而协同激活CyclinE启动子。 8 hhLIM通过KLF5协同激活CyclinE表达促进细胞增殖Western Blot结果显示,不管有无PDGF-BB刺激,特异性敲低KLF5后CyclinE的表达水平显著降低。而特异性敲低hhLIM后CyclinE的表达变化不明显。说明,hhLIM促进Cyclin E的作用是通过KLF5来实现的。整体动物实验也证明,与模型组(3.33±0.26)相比,特异性敲低KLF5组(0.5±0.5)的大鼠血管内膜/中膜比值明显降低,PCNA阳性染色细胞数也明显降低(P0.05)。特异性敲低hhLIM组(5.0±1.7)与模型组相比,无明显的抑制增殖作用,反而有轻微促增殖作用。Western blot结果进一步表明,特异性敲低KLF5的大鼠血管CyclinE的表达水平较其他组明显降低。上述结果在整体水平及细胞水平证实,hhLIM通过KLF5协同激活CyclinE表达促进细胞增殖。 结论: 1 PDGF-BB促进VSMC细胞周期的进程 2 PDGF-BB促进hhLIM的表达和KLF5与hhLIM的相互作用 3 KLF5与hhLIM协同促进细胞增殖 4 KLF5和hhLIM通过协同促进Cyclin E的表达促进细胞增殖 5 hhLIM通过KLF5协同激活CyclinE表达而促进细胞增殖
[Abstract]:Objective : To investigate the proliferation of vascular smooth muscle cell ( SMC ) in hypertension , atherosclerosis and restenosis of vascular restenosis . Many growth factors and cytokines may induce the proliferation of vascular smooth muscle cells . The platelet - derived factor BB ( PDGF - BB ) has a strong effect on the proliferation of vascular smooth muscle cells .


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本文编号：1822085