登革病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17中的适应性及生物学特性研究

发布时间：2018-04-30 08:04

  本文选题：登革病毒 + 人胚肺二倍体细胞　； 参考：《北京协和医学院》2012年硕士论文

【摘要】：登革病毒(dengue virus,DEN)属于黄病毒科黄病毒属中的一个血清型亚群,主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播,引起登革热(dengue fever,DF)以及发病率和死亡率很高的登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)。尤其近年来,由于全球气候变暖、人口流动频繁等因素,登革热在全世界的发病率提高了近30倍。在过去两年中全球登革热感染人群的数量持续增长,在东南亚中部和南部地区、美国以及南太平洋地区,每年约8000万人感染登革病毒,估计24000人死亡,超过100个国家的30亿人受到威胁,已成为世界性的公共卫生问题。迄今为止全球仍没有获准上市的登革病毒疫苗,因此登革疫苗研发迫在眉睫。目前最有潜力的传统减毒活疫苗候选株是由泰国沃特瑞德研究所(WRAIR)研发的以犬肾细胞和恒河猴胚肺细胞为基质的疫苗[3],Vero细胞也被认为是疫苗开发的候选基质,以人源性细胞制备的登革疫苗候选株还未见报道。因此研究登革病毒在人源性细胞上的适应性对于登革病毒疫苗的研发具有重要意义。 人二倍体细胞系KMB17取自人胚胎肺组织,为医学生物学研究所自建并经卫生部批准用于甲型肝炎疫苗的大规模生产的细胞株.其安全性和细胞稳定性都得到了广泛验证。 本研究对中缅边境采集的100份登革热病人血清样本进行编号和基本信息登记后,通过登革病毒IgM. IgG抗体检测试剂盒对血清样本进行抗体检测。经过统计和分析,在这些样本中,Ig M/Ig G阴性的样本仅占总样本数的5%,Ig M阳性/Ig G阴性的样本占总样本数的26%,而Ig G阳性的样本所占比例高达69%。样本接种C6/36细胞扩增后经血凝效价测定,无能够使新鲜鹅血红细胞凝集的样本。由于IgM/Ig G阳性样本所占比例高达95%,要从中分离活病毒并进行基因分析十分困难。通过与广东省CDC合作,获得了Ⅰ-Ⅳ型登革病毒8个中国株,将其分别在C6/36细胞上进行毒种扩增和滴度测定后,以卫生部公布的登革病毒通用引物及Ⅰ～Ⅳ型登革病毒型特异性引物通过RT-PCR法进行型别鉴定。经鉴定的毒株以4.0MOI在人胚肺二倍体细胞KMB17上反复传代,直至登革病毒能在KMB17细胞中引起显著病变,然后进行培养条件优化,确定其最佳感染条件。将病变毒株在KMB17细胞中连续传代10代,选育出良好的细胞适应株,并经过三轮噬斑纯化。微量滴定法检测1-10代病毒的感染性滴度,免疫荧光法检测病毒纯化株的抗原性,实时荧光定量法进行增殖动力学研究。病毒培养液经蔗糖梯度离心和超速离心纯化后,电镜检测病毒颗粒形态。结果显示,将Ⅰ～Ⅳ型登革病毒中国株提取RNA进行RT-PCR,能分别扩增出511bp的登革病毒特异性基因和482bp、119bp、290bp和392bp的型特异性基因；毒株接种C6/36细胞收获扩增的病毒液,将此病毒液感染KMB17细胞并经过反复传代后,可使KMB17产生明显的细胞病变(CPE)；将病毒适应株在KMB17细胞上进行10代连续传代培养,细胞病变速度逐渐增快,至第10代达到增殖高峰。分别经三轮噬斑纯化后筛选出四型纯化毒株,免疫荧光法检测感染KMB17细胞的纯化株病毒的抗原性,结果均呈阳性,病毒经纯化后电镜下显示形态正常增殖动力学研究显示,登革病毒适应株在KMB17细胞中接种后第3天已经开始增殖,在第5-6天增殖最为迅速,在第7天病毒增殖达到最高峰。本研究选育出了能在KMB17细胞中稳定增殖且病毒滴度较高的细胞适应株,为下一步研究登革病毒灭活疫苗和减毒活疫苗奠定基础。
[Abstract]:dengue virus ( DEN ) belongs to a serological subgroup of the Flaviviridae family of Flaviviridae , which is mainly transmitted through the media insects such as aegypti and aegypti , causing dengue fever ( DF ) as well as dengue hemorrhagic fever ( DHF ) and dengue shock syndrome ( DSS ) with high morbidity and mortality . Especially in recent years , the incidence of dengue fever has increased nearly 30 times worldwide due to global warming and frequent population movements . In the past two years , the number of dengue - infected people has continued to grow . In the central and southern regions of South - East Asia , more than 3 billion people in the United States and the South Pacific region have been threatened and have become world - sex public health problems . So far , the most potential candidate strains of attenuated live vaccine have not yet been reported . Therefore , the adaptability of dengue virus to human - derived cells is of great significance for research and development of dengue virus vaccines .

Human diploid cell line KMB17 is taken from human embryonic lung tissue and is established by the Institute of Medical Biology and approved by the Ministry of Health for large - scale production of hepatitis A vaccine . Its safety and cell stability are widely verified .

In this study , 100 dengue fever human serum samples collected at the Sino - Myanmar border were numbered and registered with basic information , and IgM was detected by dengue virus . In this paper , we have obtained 8 Chinese strains of dengue virus type 鈪，

本文编号：1823750