肠出血型大肠埃希菌O157:H7 EspF蛋白靶向结合线粒体并诱导细胞凋亡的研究

发布时间：2018-05-02 03:37

本文选题：肠出血型大肠埃希菌EHEC + O157：H7　；参考：《南方医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：一、研究背景和目的肠出血型大肠埃希菌[(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)0157：H7是一种食源性人畜共患肠道病原微生物,可引起人和动物严重的腹泻、出血性肠炎(haemorrhagic colitis, HC)、溶血性尿毒综合症(Haemolytic uraemic syndrome,HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thromobocytopenic porpura, TTP)等。1983年,Riley等首次报道了发生美国的肠出血型大肠埃希菌0157:H7引起的严重食源性疾病一出血性结肠炎。此后,由EHEC O157:H7引起的散发病例和小型暴发在世界范围内不断发生。2000年,据世界卫生组织(WHO)报告,在加拿大Ontario市Walkerton区发生了一起5000人口的EHEC O157:H7的暴发流行,其中27人住院治疗,5人死亡,据报道暴发流行是出Valkerton区的供水系统受到污染引起的。世界各地,肠出血型大肠埃希菌0157:H7的暴发与流行仍时有发生,发病呈上升趋势,由于病情凶险,病死率高(HUS死亡率90%以上),已引起各国政府及医疗卫生、科研机构的高度重视。 EHEC O157:H7的致病机制目前尚不十分清楚,其主要致病基因有志贺样毒素基因(stx)、大毒力质粒pO157和染色体肠细胞脱落位点LEE(the locus of enterocyte effacement, LEE)致病岛等。EHEC O157:H7感染引起的典型病理特征是肠上皮细胞黏附-抹去(attaching and effacing, A/E)损伤。目前研究认为,引起黏附-抹去(attaching and effacing, A/E)损伤的毒力因子大多位于其LEE致病岛,效应蛋白多达20多种,其中效应蛋白EspF的作用范围最大,是多功能性的。EspF蛋白可以突破肠上皮屏障,定位于宿主细胞的线粒体,启动线粒体途径的凋亡,且EspF的N端是线粒体靶向信号(mitochondrial targeting signal,MTS)功能区,因为将MTS区缺失突变,EspF蛋白靶向结合于宿主线粒体的功能消失。利用谷氨酸代替EspF的第16位亮氨酸,EspF靶向结合于宿主细胞线粒体的功能完全消失,因此认为MTS的第16位亮氨酸是EspF蛋白重要的功能部位。EspF蛋白迁移到宿主细胞线粒体后,与线粒体靶向结合,启动细胞线粒体途径的凋亡：引起线粒体膜通透性改变,进而导致细胞线粒体膜电位降低,细胞色素C从线粒体释放到细胞浆,引起Caspase家族蛋白酶-9和Caspase家族蛋白酶-3的裂解。感染后期EspF在核仁聚集,并且这一过程受线粒体调控,这种机制的阐明将为细菌蛋白在宿主细胞的时空调控机制揭开新的篇章。近来,一些研究发现EspF可以通过SH3和EVH1结构域分别与宿主蛋白SNX9(sorting nexin9)和Wiskott-Aldrich综合征蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASP)结合,认为EspF集合SNX9和WASP,形成新的信号模仿物,导致上皮细胞紧密连接破坏、微绒毛消失、细胞骨架重排、肌动蛋白聚集、垫状结构(pedestal)形成,最后引起细胞程序性凋亡,这在A/E损伤中起主要作用。学术界,效应蛋白EspF被认为是病原细菌致病的瑞士军刀,对于研究EHEC致病的分子机制至关重要。尽管近些年对EspF有了更深一步的研究,证实EspF可以突破肠上皮屏障,降低宿主细胞的跨膜电阻,破坏肠屏障功能,参与破坏肠上皮细胞紧密连接,但EspF蛋白诱导宿主细胞死亡的机制仍然不是很清楚。那么EHEC O157:H7的EspF蛋白,是否对细菌的黏附性、在宿主细胞的定位及对线粒体途径的凋亡都有影响呢?本实验的前期研究中,我们采用重叠延伸PCR(OL-PCR)和同源重组技术,已成功构建了espF基因缺失突变株EHEC O157:H7(△espF),(?)亥突变株表达的EspF蛋白N端第15-68个氨基酸残基缺失,这就为我们进一步研究EspF蛋白的功能奠定了基础。鉴于目前尚缺乏商品化EHECO157：H7EspF蛋白抗体,本研究从制备EHECO157：H7EspF蛋白多克隆抗体开始,并进行纯化和鉴定,进而运用该抗体通过细胞免疫荧光技术证明EHEC0157:H7EspF蛋白和宿主细胞线粒体的共同定位趋势,并用线粒体膜电位检测试剂盒比较野生株和突变株引起宿主细胞早期凋亡的程度,可望揭示EspF蛋白在EHECO157:H7感染导致肠上皮细胞产生黏附-抹去损伤中的分子机制。二、研究方法 1.肠出血型大肠埃希菌0157:H7EspF蛋白多克隆抗体的制备和初步纯化 (1)抗原设计与合成应用DNAStar软件子程序Protean,分别采用Hopp-Woods和Kyte-Doolittle方案预测氨基酸亲水性,采用Karplus-Schultz和Emini方案预测柔韧性及表面可能性,采用Jameson-Wolf方案和吴氏抗原指数法预测潜在的B细胞抗原表位。选取B细胞表位的优势区段,在其C端通过半胱氨酸(Cys)偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)。设计的抗原委托上海吉尔生化有限公司合成。 (2)多克隆抗体的制备和初步纯化2只新西兰白兔(体重1.5-2.5kg,分别编号为1、2),免疫前耳缘静脉取血2ml,分离血清,-20℃冷冻保存作为对照。免疫时间为第1、28、42、66天,每次用量为1mg／兔。抗原蛋白溶于2ml生理盐水,初次免疫时与等体积的福氏完全佐剂乳化均匀,家兔背部及肩胛部皮内多点注射(2ml/只),加强免疫时用福氏不完全佐剂乳化均匀,家兔两肩两腿部肌肉注射。在第二次加强免疫后,采兔耳缘静脉血lml制备血清,ELISA测定抗血清效价,以检验是否有抗体产生。最后一次免疫10d后,ELISA测定抗血清效价,心脏取全血约80ml,分离血清,-20℃分装冻存备用。通过间接ELISA检测抗血清效价,Western blot检测抗血清特异性。并用辛酸-硫酸铵法纯化抗血清,SDS-PAGE检测抗体纯度。 2. EHEC分泌的EspF蛋白在宿主lovo细胞的亚定位共聚焦培养皿接种lovo细胞,至细胞长满至80%。肠出血型大肠埃希菌0157:H7(野生株和espF基因缺失突变株(△espF)),190rpm,37℃摇动孵育12h。细菌作用于细胞2h(细胞：细菌=1:100)(空白对照control未加细菌作用)。PBS洗涤三遍,10min/次。4%多聚甲醛室温固定30min。0.05%Triton室温作用20min。PBS洗涤2次,5min/次。含1%BSA的PBS室温封闭1h。稀释1抗4℃孵育18h。PBS洗涤三次,10min/次。荧光2抗室温避光孵育45min。PBS洗涤三次,10mmin/次。DAPI室温避光孵育3-5min。PBS洗涤2次,5mmin/次。激光共聚焦显微镜拍照、分析。 3.细菌黏附实验lovo细胞进行载玻片爬片后,细菌感染作用于细胞2h后PBS洗涤,电镜专用2.5%的戊二醛固定液置4℃固定2h,送电镜室进一步处理、镜检。 4.细胞凋亡线粒体膜电位检测24孔细胞培养板接种lovo细胞,至细胞长满至80%。肠出血型大肠埃希菌0157:H7(野生株和espF基因缺失突变株(△espF)),190rpm,37℃摇动孵育12h。细菌作用于细胞(细胞：细菌=1:100)分别0.5、1.5、2.5h(空白对照control未加细菌作用)。PBS洗涤三遍,10min/次。按照JC-1试剂盒说明书操作。荧光显微镜镜检、拍照。三、结果 1.制备和纯化了肠出血型大肠埃希菌0157:H7EspF蛋白多克隆抗体间接ELISA法检测多抗血清效价,第二次加强免疫后测定抗血清效价,1号兔子为1:1024000,2号兔子为1:512000,表明有抗体产生。加强免疫三次后1、2号白兔的抗血清效价均可达1:2048000。Western blot证实免疫前血清和EHEC0157:H7野生株及espF基因缺失突变株的EspF蛋白无反应,免疫后血清对EHECO157:H7野生株和espF基因缺失突变株的EspF蛋白均有特异性。抗血清经辛酸-硫酸铵法纯化后,SDS-PAGE电泳可见分子量为55kD和22kD的2条带,分别相当于抗体的重链和轻链,证明抗血清经纯化后可获得一定纯度的抗体。 2. EHEC分泌的EspF蛋白靶向结合于宿主细胞的线粒体细胞质内EHEC0157:H7野生株的EspF蛋白绿色荧光信号强,对应部位的线粒体热休克蛋白70的红色荧光信号也强,表现出明显的正相关性,EspF蛋白与线粒体热休克蛋白70存在明显的共同定位现象。espF基因缺失突变株EspF蛋白绿色荧光信号较强,而对应部位的线粒体热休克蛋白70的红色荧光信号或强或弱,没有明显的相关性,无共同定位趋势,说明EspF蛋白结合线粒体的能力下降。空白对照组(即未加细菌作用组)未检测到EspF蛋白的绿色荧光信号。这在沿直线的荧光信号强度扫描比对中得到进一步证实：野生株组沿直线的绿色和红色的荧光强度曲线走势是一致的,表现出明显的正相关性,而espF基因缺失突变株组沿直线的绿色和红色的荧光强度曲线走势无相关性。这也说明野生株EspF蛋白靶向结合于宿主细胞的线粒体,而突变株的结合能力下降。那么,EspF蛋白是否与细胞核结合呢?在细胞核所在部位,EHEC野生株EspF蛋白发出的绿色荧光信号比较弱,突变株则几乎观察不到绿色荧光信号。同样的沿直线进行细胞核内荧光信号强度扫描发现：EHEC野生株EspF蛋白的绿色荧光信号强度,与细胞核DNA发出的蓝色荧光信号强度走势向背,espF基因缺失突变株EspF蛋白的绿色荧光信号强度,与细胞核DNA发出的蓝色荧光信号强度走势也是向背的,都表现出明显的负相关性,这表明EHEC野生株和espF基因缺失突变株的EspF蛋白都未在细胞核聚集。 3.细菌黏附实验EHECO157:H7野生株和espF基因缺失突变株作用结肠癌细胞lovo细胞后,培养,固定,处理样品,电子显微镜观察,EHEC O157:H7野生株作用于lovo细胞2h,可见细胞膜表面聚集大量的细菌,未见细胞膜有明显损伤。突变株作用于lovo细胞2h,可见细胞膜上有较少细菌黏附,未见细胞膜有明显损伤。阴性对照DH5a作用于lovo细胞2h,可见细胞的细胞膜完整整齐,膜上有极少量细菌黏附。 4.细胞凋亡线粒体膜电位检测荧光显微镜下观察检测线粒体膜电位变化：正常细胞,为高红高绿(红：++,绿：++)。当野生株、突变株与lovo细胞作用0.5h时,EHEC野生株表现出明显的荧光强度改变,红色荧光减少,绿色荧光增加；而espF基因缺失突变株还可观察到明显的红色荧光,绿色荧光没有野生株强,说明细菌与细胞作用0.5h时,线粒体膜电位已经明显的降低,细胞已开始凋亡,且野生株比espF基因缺失突变株快。在细菌与细胞作用1.5h时,EHEC野生株红色荧光逐渐减弱,绿色荧光逐渐增强,而espF基因缺失突变株荧光强度的改变进程稍慢。在细菌与细胞作用2.5h时,EHEC野生株红色荧光基本消失,绿色荧光达到最大强度,而espF基因缺失突变株还可观察到低强度的红色荧光,说明细菌与细胞作用2.5h,野生株导致细胞凋亡程度比espF基因缺失突变株强。这表明EHEC野生株对线粒体的毒性作用明显大于espF基因缺失突变株,espF基因的缺失使EspF蛋白诱导的线粒体途径凋亡能力减弱。四、结论 1.成功地制备了效价高、特异性强的EHEC O157:H7EspF蛋白多克隆抗体。 2. EHEC O157:H7的EspF蛋白在细菌感染宿主细胞的过程中定位于宿主细胞的线粒体,且EspF蛋白的N端是线粒体靶向信号(mitochondrial targeting signal, MTS)功能区。感染过程中EspF蛋白并未在宿主细胞核聚集,这和EPEC是不同的。 3. EspF蛋白的N端缺失降低了EHEC O157:H7对宿主细胞的黏附性。 4. EspF蛋白的N端缺失减弱了线粒体途径的凋亡程度。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

【参考文献】