日本血吸虫钙网织蛋白活化抗原提呈细胞功能的分析

发布时间：2018-05-04 20:13

  本文选题：日本血吸虫 + 钙网织蛋白　； 参考：《上海师范大学》2012年硕士论文

【摘要】：日本血吸虫病仍然是流行于我国的人畜共患病之一，长期有效地控制病的流行有赖于高效安全疫苗的应用。因此，开发高效、安全、实用的抗血吸虫疫苗一直是血防研究中亟待解决的难题。大量研究表明：通过模拟辐照致弱血吸虫尾蚴或童虫疫苗（RAV）诱导的高保护性效应机理来研发高效而又安全的分子疫苗，可能是突破上述难题的有效策略之一。因此，探索RAV的高保护性效应机制成为研究者们关注的热点课题，其中，RAV的免疫原性的分子与细胞基础及其机制等问题尤其受到重视。 以前的研究还显示：钙网织蛋白（Calreticulin，CRT）是一类进化上较为保守的分子，由保守的球状N端结构域和脯氨酸富集结构域、以及酸性的C端结构域所组成，属于Ca2+结合伴侣蛋白，最初定位于内质网，参与调节蛋白质的正确折叠、基因转录和翻译后修饰等过程。最近报道，经某些药物或紫外照射等处理的肿瘤细胞以及凋亡的细胞的CRT会移位至细胞表面，从而给巨噬细胞和树突细胞（Dendritic cells, DC）等抗原提呈细胞提供了一种“eat me”信号，最终导致这些细胞被吞噬和处理；同时，在这些细胞的其他应急分子的共同作用下，还可增强肿瘤抗原的免疫原性。提示细胞表面CRT的暴露能够引起其被DC吞噬，从而诱导更强的免疫反应。另外，Naglaa El Gengehi等人鉴定了曼氏血吸虫的CRT为辐照致弱疫苗的一种免疫显性T细胞抗原，本课题组陈雷等也发现日本血吸虫的CRT（SjCRT）含有一个杂合型的Th1细胞表位，说明血吸虫的CRT可能是血吸虫RAV中的一个重要的T细胞抗原。因此，可以推断，在RA血吸虫疫苗模型中，来源于血吸虫的一些保守的应急分子如CRT和HSP70等分子可能起到了关键作用，它们很可能通过与宿主DC作用，形成引发和驱使保护性的先天和适应性免疫应答的环境。但是，血吸虫的CRT分子是否能够活化宿主的DC诱导特征性的先天免疫反应，仍有待进一步研究。因此，，本研究在克隆表达日本血吸虫CRT基础上，观察了该分子在血吸虫不同发育阶段虫体中的定位情况，并初步分析了SjCRT刺激小鼠抗原提呈细胞的功能特征，旨在为进一步阐明SjCRT在RAV中的免疫生物学功能和机制提供初步的资料。 首先，应用常规分子生物学技术克隆SjCRT分子，并在原核表达系统中表达该分子，Western bloting分析了该蛋白分子的免疫原性，免疫荧光法观察SjCRT分子在不同期别虫体中的组织定位。结果克隆和表达了日本血吸虫重组蛋白(rSjCRT)；Westen Blot分析显示，该重组蛋白免疫鼠血清可以识别7d、14d、23d、32d和42d的日本血吸虫的虫体蛋白；免疫荧光检测表明在7d、10d、14d日本血吸虫童虫体表膜呈现明显的荧光信号。 为避免原核表达的蛋白含有脂多糖（LPS）而影响后续实验，采用Bac-To-Bac杆状病毒真核表达系统进行SjCRT蛋白的表达；His柱纯化表达蛋白，Westen Blot分析蛋白免疫原性。结果在杆状病毒表达系统中表达了SjCRT蛋白；Westen Blot分析显示，纯化后的SjCRT蛋白能够被标签His单抗识别，也能被原核表达SjCRT蛋白的免疫鼠血清所识别，为后续活化DC功能的实验研究提供了材料。 RAW264.7巨噬细胞株具有较强的抗原吞噬功能，是常用的研究先天免疫功能的细胞模型。本实验采用以原核表达后除去LPS的SjCRT蛋白作为抗原观察其活化RAW264.7细胞的功能。CCK-8法检测SjCRT蛋白刺激RAW264.7细胞的增殖情况；流式细胞术检测SjCRT蛋白刺激后RAW264.7细胞表面标志分子MHCⅡ和TLR2与TLR4等受体分子的表达情况。结果表明，SjCRT蛋白能显著地刺激RAW264.7细胞的增殖(SI2)； SjCRT蛋白刺激后实验组RAW264.7细胞的MHCⅡ、TLR2和TLR4表达量显著地增强(P0.05)。提示SjCRT蛋白能够刺激RAW264.7细胞表型的成熟，且可能与TLR2和TLR4受体介导的过程相关。 为了解SjCRT是否具有活化宿主树突状细胞的功能，本研究采用上述真核表达的SjCRT蛋白刺激小鼠骨髓里来源的DC细胞，分析刺激后DC表型和功能成熟的情况。常规方法从Balb/c小鼠骨髓分离、培养和分选得到纯度较高的不成熟的DC细胞；流式细胞术检测SjCRT蛋白刺激DC细胞表面标志分子MHCⅡ、CD40和CD86的表达；ELISA法检测刺激的DC细胞培养上清中的细胞因子IFN-γ、IL-10、TNF-α和IL-6的含量。结果显示，SjCRT蛋白刺激后MHCⅡ和CD86表达显著性增强(P0.05)；DC细胞分泌到上清中的IFN-γ显著性增多(P0.05)，IL-10、TNF-α和IL-6显著性减少(P0.05)。提示SjCRT蛋白能够刺激小鼠骨髓来源的DC细胞表型的成熟，且具有促进DC细胞分泌Th1类致炎细胞因子IFN-γ的功能。 总之，本研究克隆表达了日本血吸虫CRT分子，观察到该分子能够在7d、10d、14d日本血吸虫童虫体表膜呈现，初步查明SjCRT蛋白能够活化宿主的树突状细胞和巨噬细胞，为进一步阐明SjCRT在RAV中的免疫生物学功能和机制奠定了基础。
[Abstract]:As a result , the high protective effect mechanism of RAV - induced high protective effect is one of the most effective strategies to solve the problem . Therefore , the research of RAV ' s high protective effect mechanism has become one of the most important issues of the researchers .

Previous studies have shown that Calreticulin ( CRT ) is a kind of evolutionarily conserved molecule , composed of conserved globular N - terminal domain and proline - rich domain , and acidic C - terminal domain . It is composed of conserved globular N - terminal domain and proline - rich domain , and acidic C - terminal domain . It is initially located in the endoplasmic reticulum , participates in regulating the correct folding of protein , gene transcription and post - translational modification . Recently , it has been reported that tumor cells treated with certain drugs or ultraviolet irradiation and the CRT of apoptotic cells can be shifted to the surface of the cell , thus providing a " eat me " signal to the antigen - presenting cells such as macrophages and dendritic cells ( DC ) , which eventually lead to the phagocytosis and treatment of these cells ;
In addition , Naglaa El Gengehi et al . have identified that the CRT of Schistosoma japonicum may be an important T - cell antigen in RAV of Schistosoma japonicum . In addition , Naglaa El Gengehi et al . have identified the localization of some conserved emergency molecules such as CRT and HSP70 in Schistosoma japonicum .

Firstly , SjCRT molecule was cloned by conventional molecular biology technique and expressed in prokaryotic expression system . Western bloting analyzed the immunogenicity of the protein molecule . Immunofluorescence method was used to observe the localization of SjCRT molecule in the non - synchronous insect body .
Westen Blot analysis showed that the recombinant protein immune mouse serum can recognize the worm protein of Schistosoma japonicum at 7 , 14 , 23d , 32d and 42 days .
Immunofluorescence detection showed that the body surface membrane of Schistosoma japonicum showed obvious fluorescence signal at 7d , 10d and 14d .

In order to avoid the effect of LPS on the expression of SjCRT protein in prokaryotic expression system , the expression of SjCRT protein was carried out in the eukaryotic expression system .
The results showed that SjCRT protein was expressed in baculovirus expression system .
Western blot analysis showed that SjCRT protein after purification can be identified by tag His monoclonal antibody , and can be recognized by the immune mouse serum of SjCRT protein expressed by prokaryotic expression , which provides the material for experimental research on subsequent activation of DC function .

RAW264.7 macrophage strain has a strong antigen - phagocytic function and is a common cellular model to study innate immune function . SjCRT protein is used as antigen to observe the function of activated RAW264.7 cells . CCK - 8 is used to detect the proliferation of RAW264.7 cells stimulated by SjCRT protein .
The expression of MHC 鈪

本文编号：1844471