病原体Clostridum difficile的乙酰辅酶A合成通路中某些关键金属蛋白的基因克
本文选题:艰难梭菌 + 乙酰辅酶A合成通路 ; 参考:《复旦大学》2011年博士论文
【摘要】:厌氧病原体艰难梭菌(Clostridium difficile)能够直接感染人类导致结肠炎和结肠癌(简称为CDI),在北美和欧洲发现较多,发病率和死亡率较严重,目前在中国也已有报道。由于该病原体极度厌氧,对研究和疾病防治带来较大困难。 艰难梭菌基因组测序结果表明:该病原体基因组中存在乙酰辅酶A合成通路(Wood-Ljungdah通路)中所有相关同源蛋白,主要包括甲基转移酶、钴铁硫蛋白、乙酰辅酶A合成酶和一氧化碳脱氢酶等。该通路是许多厌氧微生物中重要的能源和物质代谢通路之一,并且不存在于人体中。因此,这些蛋白(酶)有可能成为治疗Clostridium difficile所引发疾病的潜在药物靶点。本文研究的主要目的是为病原体中该通路的后续详细研究奠定基础,并为相关药物的开发提供设计思路。 本文研究了病原体C. difficile 630的乙酰辅酶A通路中的四种关键酶(蛋白),包括甲基转移酶(MeTrCd,268个氨基酸)、钴铁硫蛋白(CoFeSPCd,包括两个亚基delta和gamma,分别含314个氨基酸和455个氨基酸)、乙酰辅酶A合成酶(ACSCd,708个氨基酸)和一氧化碳脱氢酶(CODHCd,639个氨基酸)。 首先,我们研究了病原体C. difficile 630中编号为CD0727的甲基转移酶基因(MeTrCd),包括基因克隆、重组表达与纯化,成功建立了高效大肠杆菌表达纯化体系(蛋白产量可达50 mg每升TB培养基);使用圆二色光谱对其二级结构进行了表征;通过序列和结构分析及生物信息学,得到了其同源模拟结构。 研究了病原体C. difficile 630中编号为CD0725和CD0726(分别编码钴铁硫蛋白gamma和delta亚基)的基因,通过基因克隆、重组表达与纯化研究,成功建立了一套较为高效的重组表达体系;对CoFeSPCd的金属中心Fe4S4和钻胺素的化学重组进行了研究,并运用紫外可见光谱对其进行表征,实验结果表明我们通过重组得到的CoFeSPCd是具有完整金属中心的全蛋白。 通过色氨酸荧光淬灭光谱测定了甲基四氢叶酸的底物结合常数,及其随pH值减小的构象变化现象。实验结果表明MeTrCd的底物结合能力与同源蛋白MeTrMt(来源于嗜热菌Moorella thermoaceticum的MeTr)相比有显著下降。该差异可能是由MeTrCd中底物结合位点腔His1l的存在造成的。色氨酸荧光淬灭光谱实验表明MeTrCd存在pH依赖性的构象变化性质。该变化导致蛋白疏水区域的色氨酸残基溶剂暴露程度加大,从而有利于底物结合及完成催化功能。 通过厌氧条件下的截流光谱技术详细研究了MeTrCd的甲基转移反应动力学,得到了MeTrCd与外源性CoFeSPMt(来源于嗜热菌Moorella thermoaceticum的CoFeSP)和钻铵素反应的米式方程动力学参数。通过厌氧条件下的截流光谱技术检测了CoFeSPCd接受甲基的功能,并通过改变CoFeSPCd的浓度得到了以CoFeSPCd为底物的MeTrCd催化甲基动力学常数。研究发现分别使用CoFeSPMt、钴铵素和CoFeSPCd作为催化底物,无论是催化速率常数(Kcat)还是催化效率(Kcat/Km)都遵循这样一个规律:CoFeSPMtCoFeSPCd钴胺素。该规律进一步验证了我们的推论即当使用MeTrCd-CoFeSPCd同源反应体系时,其相互作用的增强有利于甲基转移反应的完成。采用计算机模拟分子对接研究对MeTr和CoFeSP的相互作用进行了研究,结果表明MeTr和CoFeSP相互作用有可能采取侧面进攻(Conform3)的方式完成,并且CoFeSPCd与MeTrCd相互作用时的交界面处氨基酸的盐桥、氢键等起了重要的稳定作用。 本文详细研究了乙酰辅酶A合成酶。首次建立了病原体C. difficile 630乙酰辅酶A合成酶(ACSCd)的大肠杆菌体外重组表达纯化体系;通过金属含量分析、紫外可见光谱以及EXAFS等光谱研究表明ACSCd在结构上具有ACSMt(来源于嗜热菌Moorella thermoaceticum的ACS)的典型金属活性中心A-cluster;活性测定实验表明ACSCd的乙酰辅酶A合成活性速率常数为0.04μM min-1mg-1、甲基转移酶活性速率常数为0.26±0.05 min-1;对ACSCd的抑制剂进行了初步的研究,并发现三种抑制剂均能有效抑制其活性;离体抑菌活性研究进一步验证了它们对病原体C.difficile的抑制效果。这一研究具有十分重大的理论意义和应用价值,有可能成为寻找治疗CDI疾病药物的一个新策略。 此外,我们对一氧化碳脱氢酶的基因克隆、蛋白质重组表达纯化进行了初步的研究探索。一氧化碳脱氢酶(CODH)的功能是催化CO和CO2的可逆氧化还原,它是乙酰辅酶A通路中的重要金属酶之一,但是该蛋白很容易以包涵体沉淀的形式存在,人们一直未能建立该蛋白的大肠杆菌表达体系。本文通过构建多个原核表达质粒,对嗜热菌Moorella thermoacetica的CODHMt以及病原体CODHCd的重组表达纯化进行了一系列的探索,我们得到了含有麦芽糖融合标签的蛋白。这一研究为将来详细研究CODH的结构与功能奠定了基础。 总之,本文对艰难梭菌(Clostridium difficile)乙酰辅酶A合成通路中的四种关键酶(蛋白)进行了基因构建、重组表达与纯化的研究探索,成功得到了其中3种酶(蛋白)的高效表达纯化体系,并进行了详细的结构、功能与性质及抑制剂的研究。该研究不仅增进了人们对该病原体的认识和对乙酰辅酶A合成通路的了解、而且为开发新型治疗CDI药物提供了理论依据和思路。
[Abstract]:Clostridium difficile, an anaerobic pathogen, can directly infect humans and lead to colitis and colon cancer (called CDI). It has been found more in North America and Europe, with severe morbidity and mortality, and is also reported in China. The pathogen is extremely difficult for research and disease control because of the extreme anaerobic condition of the pathogen.
The genome sequencing of Clostridium difficile showed that the pathogen genome exists all related homologous proteins in the acetyl coenzyme A pathway (Wood-Ljungdah pathway), mainly including methyltransferase, cobalt iron sulphide protein, acetyl coenzyme A synthetase, and carbon monoxide dehydrogenase, which are important energy and substances in many anaerobic microorganisms. It is one of the metabolic pathways and does not exist in the human body. Therefore, these proteins (enzymes) may be potential drug targets for the treatment of Clostridium difficile diseases. The main purpose of this study is to lay the foundation for subsequent detailed study of the pathway in the pathogen and to provide a design idea for the development of related drugs.
This paper has studied four key enzymes (proteins) in the acetyl coenzyme A pathway of the pathogen C. difficile 630, including methyl transferase (MeTrCd, 268 amino acids), cobalt ferrothioprotein (CoFeSPCd, two subunits Delta and gamma, 314 amino acids and 455 amino acids respectively), acetyl coenzyme A synthetase (ACSCd, 708 amino acids) and carbon monoxide. Dehydrogenase (CODHCd, 639 amino acids).
First, we studied the methyltransferase gene (MeTrCd), numbered CD0727 in the pathogen C. difficile 630, including gene cloning, recombinant expression and purification. The expression and purification system of high efficiency Escherichia coli (protein yield up to 50 mg per liter TB medium) was successfully established, and the secondary structure was characterized by circular two color spectrum; Sequence and structural analysis and bioinformatics obtained their homologous structure.
The gene C. difficile 630, numbered with CD0725 and CD0726 (encoding cobalt iron sulphur protein gamma and delta subunit respectively), was studied by gene cloning, recombinant expression and purification. A set of more efficient recombinant expression system was successfully established, and the chemical recombination of the metal center Fe4S4 and TW of CoFeSPCd was studied. It was characterized by UV Vis spectroscopy. The results showed that the CoFeSPCd obtained by recombination was a complete protein with a complete metal center.
By fluorescence quenching of tryptophan, the substrate binding constant and the conformation change with the pH value of methylenetetrahydrofolate were measured. The experimental results showed that the substrate binding capacity of MeTrCd was significantly lower than that of the homologous protein MeTrMt (from the MeTr of thermophilic Moorella thermoaceticum). This difference may be from the substrate in MeTrCd. The fluorescence quenching spectra of tryptophan showed that the presence of His1l in the site of the site of tryptophan showed that there was a pH dependent conformation change in MeTrCd, which resulted in the increased exposure of tryptophan residues in the hydrophobic region of the protein, which was beneficial to the substrate binding and the catalytic function.
The kinetic parameters of methyl transfer reaction of MeTrCd were studied in detail by intercepting spectroscopy under anaerobic conditions. The kinetic parameters of MeTrCd and CoFeSPMt (CoFeSP derived from thermophilic Moorella thermoaceticum) and ammonium drilling were obtained. The CoFeSPCd acceptance was detected by the interception spectrum technique under anaerobic conditions. The function of the base was obtained by changing the concentration of CoFeSPCd to catalyze the methyl kinetic constant of MeTrCd with CoFeSPCd as the substrate. It was found that using CoFeSPMt, cobaltin and CoFeSPCd as a catalytic substrate, both the catalytic rate constant (Kcat) and the catalytic efficiency (Kcat/Km) all follow such a rule: CoFeSPMtCoFeSPCd cobalt amide. This rule further validates our inference that the enhancement of interaction is beneficial to the completion of the methyl transfer reaction when using the MeTrCd-CoFeSPCd homologous reaction system. The interaction between MeTr and CoFeSP is studied by computer simulation molecular docking. The results show that the interaction between MeTr and CoFeSP may take side into the side. The way of attack (Conform3) is completed, and the salt bridge and hydrogen bond of the amino acid interface at the interface between CoFeSPCd and MeTrCd play an important stabilizing role.
In this paper, the acetyl coenzyme A synthetase was studied in detail. The recombinant expression and purification system of Escherichia coli was established for the first time by the pathogen C. difficile 630 acetyl coenzyme A synthetase (ACSCd). Through the analysis of metal content, UV visible spectrum and EXAFS, it showed that ACSCd had ACSMt (from the thermophilic Moorella thermoa) in the structure. The typical metal active center A-cluster of ACS of ceticum; the activity determination experiment showed that the rate constant of ACSCd acetyl coenzyme A synthesis activity was 0.04 u M min-1mg-1, the rate constant of methyltransferase was 0.26 + 0.05 min-1; the inhibitor of ACSCd was preliminarily studied, and all three inhibitors could effectively inhibit its activity; The study of body inhibitory activity further verified their inhibitory effect on the pathogen C.difficile. This study is of great theoretical significance and application value, and may become a new strategy for the search for drugs for the treatment of CDI disease.
In addition, we have studied the gene cloning of CO dehydrogenase and the recombinant protein expression and purification. The function of carbon monoxide dehydrogenase (CODH) is to catalyze the reversible redox of CO and CO2. It is one of the important metal enzymes in the acetyl coenzyme A pathway, but it is easy to exist in the form of inclusion body precipitation. We have been unable to establish the protein expression system of Escherichia coli. In this paper, a number of prokaryotic expression plasmids were constructed, and a series of studies on the recombinant expression and purification of the thermophilic Moorella thermoacetica CODHMt and the pathogen CODHCd were carried out. We have obtained the protein containing maltose fusion label. It lays the foundation for the structure and function of CODH.
In a word, four key enzymes (proteins) in the Clostridium difficile acetyl coenzyme A synthesis pathway were constructed, the recombinant expression and purification were studied. The efficient expression and purification system of 3 enzymes (proteins) was successfully obtained, and the detailed structure, function and properties and inhibitors were studied. The study not only enhances the understanding of the pathogen and the understanding of the acetyl coenzyme A synthesis pathway, but also provides a theoretical basis and ideas for the development of a new treatment of CDI drugs.
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R346
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,本文编号:1844487
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