携带hBMP-2的tet-on慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞及Hbmp-2的体外表达

发布时间：2018-05-07 23:17

  本文选题：可诱导慢病毒 + 人脐带间充质干细胞　； 参考：《青岛大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的：研究携带hBMP-2的tet-on慢病毒载体对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)的转染及转染后hBMP-2在强力霉素诱导下的表达情况。 方法：按照文献方法培养人脐带间充质干细胞,消化传代,转染前一天,选取3.4代生长状态良好的HUCMSCs按照融合度40%接种到六孔板中,第二天进行pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA、pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP2共转染,转染后8h更换培养液。待培养24h之后用嘌呤霉素和G418进行稳定筛选。提取DNA进行PCR检测,确定基因是否已成功转入。选取稳定筛选后的脐带间充质干细胞,分别在不同强力霉素诱导浓度相同诱导时间和不同诱导时间相同强力霉素诱导浓度情况下用ELISA测定hBMP-2的表达情况。。对转染前后的HUMSCs进行成骨诱导,用茜素红染色法观察矿化物结节形成情况。 结果：携带hBMP-2的tet-on慢病毒载体可成功转染人脐带间充质干细胞,且HUCMSCs可以通过强力霉素的诱导可控性表达hBMP-2。在相同诱导时间情况下,强力霉素10μg/ml时诱导表达最强,而在相同诱导浓度下,hBMP-2的表达在诱导48h后达峰值。HUCMSCs成骨诱导培养2周后,茜素红染色示细胞浆中有大量红色的钙化基质沉积。 结论：携带hBMP-2的tet-on慢病毒载体成功转染人脐带间充质干细胞,并初步研究了hBMP-2在体外强力霉素诱导下的表达情况。为进一步研究hBMP-2诱导HUCMSCs成骨分化治疗骨坏死模型奠定实验基础,并提供了一种新的实验思路。
[Abstract]:Objective: To investigate the expression of hBMP-2 Tet-on lentivirus vector in the transfection of human umbilical cord mesenchymal stem cells (human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUCMSCs) and the expression of hBMP-2 under the induction of doxycycline.
Methods: human umbilical cord mesenchymal stem cells were cultured in accordance with the methods of literature and digested. The day before transfection, the 3.4 generation of HUCMSCs with good growth status were selected to be inoculated into six pore plates according to the fusion degree 40%. In second days, pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA, pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP2 were co transfected, and 8h was replaced after transfection. After 24h, purine was used. A stable screening of mycophenin and G418 was carried out. DNA was extracted and PCR was detected to determine whether the gene had been successfully transferred. The stable screening of umbilical cord mesenchymal stem cells was selected, and the expression of hBMP-2 was determined by ELISA under the same induction time of the induced concentration of doxycycline and the induced concentration of the same doxycycline at different induction time, respectively. Before and after transfection, HUMSCs was induced by osteogenesis and alizarin red staining was used to observe the formation of mineralized nodules.
Results: the tet-on lentivirus carrier with hBMP-2 can transfect human umbilical cord mesenchymal stem cells successfully, and HUCMSCs can express the strongest expression of hBMP-2. at the same induction time with the induction time of doxycycline under the same induction time. At the same induction concentration, the expression of hBMP-2 can reach the peak.HUCMS after the induction of 48H. After 2 weeks of osteogenic induction, alizarin red staining showed that there were a large number of red calcified matrix deposits in the cytoplasm of Cs.
Conclusion: the tet-on lentivirus carrier carrying hBMP-2 was successfully transfected into human umbilical cord mesenchymal stem cells, and the expression of hBMP-2 induced by doxycycline in vitro was preliminarily studied, which lay the foundation for further study on the osteonecrosis model of HUCMSCs osteogenesis induced by hBMP-2, and provided a new experimental idea.

【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

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本文编号：1858903