一种分离正常成年大鼠肝脏祖细胞新方法的研究

发布时间：2018-05-13 02:44

本文选题：肝脏祖细胞 + 四步灌流法　；参考：《浙江大学》2011年硕士论文

【摘要】：研究背景：急性肝衰竭是一种可以由各种急性或慢性肝病引起的少见但致命的疾病。目前肝移植被认为是终末期肝病患者重要的治疗方法。然而,肝移植的可行性受到成本高、供体器官短缺、手术技术要求高、需要服用免疫抑制剂等因素的限制。由于各种肝衰竭多由肝功能紊乱所致,而肝细胞或肝细胞样细胞移植后可发挥正常功能,因此,肝细胞或肝细胞样细胞移植是急性和慢性肝功能衰竭很有前途的替代疗法之一。不过这种疗法同样受到供体细胞的缺乏和免疫排异的限制。肝干/祖细胞有良好的增殖潜能,且有较低的免疫源性,有可能用于细胞移植以取代肝移植治疗终末期肝病。因此,对诸如成熟细胞或干/祖细胞的移植以及移植异种器官的研究方兴未艾。大量研究表明肝干/祖细胞存在于成年啮齿类动物和成人的肝脏中,这群细胞共表达肝细胞和干细胞的表面标志。然而,目前研究认为在正常成年肝脏中,肝干/祖细胞处于静止状态,仅有少量肝干/祖细胞出现于汇管区,且只有受到严重创伤时才会出现肝干/祖细胞的增殖。最近,不少有关肝衰竭模型的研究指出,从这些模型中可以分离出大量的肝干/祖细胞,如二乙基亚硝胺模型大鼠、2-AAF/肝切模型大鼠以及倒千里光碱/肝切模型大鼠。尽管应用的化学试剂多种多样,但这些实验方法的目的都是为了使造模动物产生严重、持续的肝损伤。虽然从这些疾病模型动物中可以分离出大量的肝干/祖细胞,但这些细胞都来自于异常个体。有假说称在整个肝癌的发展过程中,肝干/祖细胞发挥重要的作用。那么即使大量的肝干/祖细胞可以分离自肝脏,但细胞的品质无法得到保证。目前为止,尚无一种好的实验方法能够获得大量的纯度高、活性好的肝干/祖细胞,肝干/祖细胞体外分离、纯化、鉴定、体外培养技术有待于进一步完备,这些因素都是制约肝干/祖细胞临床应用的瓶颈。研究目的：利用正常肝脏探索建立一套肝干/祖细胞的分离、培养、鉴定的新方法。研究方法：通过四步胶原酶灌注法与密度梯度离心技术相结合,分离正常成年大鼠肝祖细胞。通过形态学观察、RT-PCR和免疫细胞化学分析肝祖细胞的形态、表型。研究结果：采用本课题组建立的四步胶原酶灌注法与密度梯度离心技术相结合,可从正常大鼠肝脏中分离出细胞数为2.5±0.5×104/100g的肝祖细胞,肝祖细胞的活率是95%±2%。新鲜分离的大鼠肝祖胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液制成肝祖细胞悬液接种于培养瓶中体外培养。结果显示体外培养的第3天,肝祖细胞可形成松散的克隆,细胞形态上为圆形或卵圆形。在体外30天的培养期间,这些细胞缓慢增殖,并显示出祖细胞的特性。RT-PCR结果显示这群祖细胞不仅表达成熟肝细胞的表面标志ALB、AFP、CK18、CK19、HNF-1a、HNF-4a的mRNA,还表达造血干细胞的表面标志Thy-1、CD45的mRNA。免疫细胞化学染色表明这群细胞表达ALB、AFP、CK18、CK19、Thy-1和OV-6。结论：通过简单有效的四步灌流法结合密度梯度离心法所获得的肝祖细胞有良好的增殖能力,能表达干细胞和肝细胞的表面标志,为肝干／祖细胞移植提供了良好的细胞来源。
[Abstract]:Background of Study :

Liver stem / progenitor cells are considered to be an important therapeutic method for acute and chronic liver disease . However , the liver stem / progenitor cells can be isolated from the liver , and the liver stem / progenitor cells can be used for the treatment of end - stage liver diseases .

Purpose of study :

A new method for isolation , culture and identification of liver stem / progenitor cells was established using normal liver .

Study method :

Normal adult rat liver progenitor cells were isolated by four - step collagenase perfusion and density gradient centrifugation . The morphology and phenotype of hepatic progenitor cells were observed by morphological observation , RT - PCR and immune cells .

Results of the study :

The results of RT - PCR show that these cells express ALB , AFP , CK18 , CK19 , HNF - 1a , HNF - 4a mRNA , and also express ALB , AFP , CK18 , CK19 , Thy - 1 and OV - 6 .

Conclusion :

The hepatic progenitor cells obtained by the simple and effective four - step perfusion method combined with density gradient centrifugation have good proliferative capacity , can express the surface markers of stem cells and liver cells , and provide good cell sources for liver stem / progenitor cell transplantation .

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【参考文献】