耻垢分枝杆菌WecA蛋白的表达及wecA基因敲除对耻垢分枝杆菌内其他蛋白的影响

发布时间：2018-05-20 06:01

  本文选题：耻垢分枝杆菌 + L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺衔接双糖　； 参考：《大连医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是结核病的致病菌，全球大约有1/3人口携带过这种杆菌。近年来，由于几种药物长时间使用，使得结核杆菌出现耐多药甚至广泛耐药特性。因此迫切需要寻找抗结核药物的新靶点。 耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和结核分枝杆菌同属于分枝杆菌属，而对于结核分枝杆菌细胞壁的研究，通常利用与结核分枝杆菌有相同细胞壁结构，但生长快速且无致病性的耻垢分枝杆菌mc2155菌株作为实验模型。分枝杆菌细胞壁具有其独特的结构，它的核心结构由三部分组成的，由外至内依次是分枝菌酸（mycolic acid）、聚阿拉伯半乳糖（arabinogalactan, AG）和肽聚糖（peptidoglycan, PG）。其中聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖之间是由L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺（L-rhamnose-D-N-acetyl-glucosamine）衔接双糖共价连接起来的。 L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺衔接双糖分子是维持分枝杆菌细胞壁结构稳定的重要成分，，也是分枝杆菌生存的必要条件。L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺双糖衔接分子的合成通过两步反应实现的：第一步，UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）在WecA酶（N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶）的作用下，将基团N-乙酰葡糖胺-1-磷酸（GlcNAc-1-P）转移到受体C50-P （Decaprenyl phosphate）上形成C50-P-P GlcNAc。第二步，产物再作为受体在WbbL酶（鼠李糖基转移酶)的作用下，接受一个来自于dTDP-鼠李糖（dTDP-Rhamnose）提供的鼠李糖基，最终生成L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺双糖衔接分子。L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺衔接双糖分子的合成过程中WecA酶起到重要的催化作用，找到WecA酶的基因有利于我们找到抑制WecA酶合成的方法，从而抑制L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺衔接双糖分子的合成，最终影响分枝杆菌生长。本实验室的前期的研究已经发现MSMEG4947基因为耻垢分枝杆菌的WecA蛋白编码基因wecA，同时证明了wecA是分枝杆菌生长必需基因。综上，WecA蛋白很可能是一个抗分枝杆菌尤其是结核分枝杆菌的潜在靶点。 目的： 1．使用PCR方法从耻垢分枝杆菌基因组中扩增出Sm wecA，构建pMD18-Sm wecA克隆载体；2.构建pET29b-Sm wecA表达载体，并在E. coli BL2（1DE3）、CD41（DE3）和ER2566菌株中诱导表达；3.利用高效液相色谱（HPLC）技术对WecA酶活性进行鉴定；4.利用双向电泳技术，对敲除wecA基因前后，耻垢分枝杆菌中蛋白的变化情况进行比对，来分析与WecA酶相关的蛋白。 结果： 1．使用PCR方法从耻垢分枝杆菌基因组中扩增出Sm wecA，构建pMD18-Sm wecA克隆载体 使用根据Sm wecA（MSMEG4947）基因核苷酸序列设计出的上下游引物，以M. smegmatis mc2155基因组为模板，使用LA Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，然后用QIAEXⅡGel Extraction Kit对得到的PCR产物进行回收和纯化，电泳鉴定。 将pMD18T克隆质粒与Sm wecA基因片段连接后，构建的pMD18-Sm wecA克隆载体，选取NcoⅠ和BamHIII对pMD18-Sm wecA重组质粒酶切鉴定，选取电泳鉴定正确的pMD18-Sm wecA重组质粒送于宝生物工程大连公司进行核苷酸序列的测定。 2．构建pET29b-Sm wecA表达载体，并在E. coli BL21（DE3）、CD41（DE3）、ER2566菌株中诱导表达 使用NdeⅠ和XhoⅠ的双酶切体系分别对pMD18-Sm wecA质粒和pET29b载体进行酶切，将Sm wecA基因片段和酶切后的线形pET29b载体片段连接，构建了pET29b-Sm wecA表达载体。 用pET29b-Sm wecA表达载体转化E. coli BL21(DE3)、CD41（DE3）和ER2566菌株，在37℃下用终浓度1mM的IPTG诱导将上清、沉淀和总蛋白进行Dot blot，SDS-PAGE和Western blot分析。 在25℃条件下用终浓度1mM的IPTG诱导pET29b-Sm wecA/ER2566生长16h。超声破碎细胞后，把离心后的上清液再超速离心制备膜组分，然后用去污剂DDM（n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）处理，得到蛋白样品后进行Western blot分析。 3．利用高效液相色谱（HPLC）技术对WecA酶活性进行鉴定 使用镍层析柱纯化WecA蛋白。 建立反应体系，在反应底物UDP-GlcNAc和C50-P混合液中加入纯化的WecA蛋白共同孵育30min后，使用氯仿/甲醇/氨水萃取反应产物，使用含反应产物的水相进行HPLC检测，通过检测底物之一UDP-GlcNAc峰面积的减少量的方法来检测WecA酶的活性。 4．利用双向电泳技术，对敲除wecA基因前后，耻垢分枝杆菌中蛋白的变化情况进行比对，来分析与WecA酶相关的蛋白。 小体积培养耻垢分枝杆菌mc2155YJ-2菌株进行温度转换试验，描绘出生长曲线以确定提取蛋白时间，然后大体积培养耻垢分枝杆菌mc2155YJ-2菌株温度转换后，在相应时间段收集细菌，提取总蛋白。以未经过温度转化的耻垢分枝杆菌mc2155YJ-2菌的总蛋白作对照。 对两种总蛋白样品分别进行水化，等电聚焦电泳，平衡，SDS-PAGE电泳。电泳结束后，使用银染试剂盒对两块凝胶进行染色。对两块凝胶进行比对，寻找差异点。 结论： 1．从耻垢分枝杆菌基因组中获取Sm wecA基因，构建了pET29b-Sm wecA表达载体，并在ER2566中得到表达。 2．纯化了表达出来的耻垢分枝杆菌WecA酶，通过HPLC的方法检测了酶的活性，进一步验证了MSMEG4947基因为耻垢分枝杆菌的WecA蛋白编码基因wecA。为揭示耻垢分枝杆菌的WecA酶催化特性奠定了基础。作为结核分枝杆菌WecA酶活性研究的重要补充，反映出分枝杆菌中WecA酶具有GlcNAc-1-P转移酶活性特点。 3．利用双向电泳技术对wecA敲除前后耻垢分枝杆菌mc2155菌体内总蛋白变化情况进行了初步的比对分析。为后续对WecA酶相关蛋白的分析探寻了一条道路。
[Abstract]:Mycobacterium tuberculosis is a pathogen of tuberculosis , about 1 / 3 of the world ' s population carries the bacillus . In recent years , due to the long - term use of several drugs , the mycobacterium tuberculosis has multiple drug - resistant and even broad - resistant characteristics . Therefore , it is urgent to find new targets for anti - tuberculosis drugs .

Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis belong to the genus Mycobacterium , and for the study of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis , it is common to use Mycobacterium tuberculosis mc2155 strain with the same cell wall structure as Mycobacterium tuberculosis as the experimental model . The cell wall of Mycobacterium tuberculosis has its unique structure , and its core structure consists of three parts , which are mycolic acid , poly - Arabinose ( AG ) and peptidoglycan ( PG ) . wherein the poly - arabonic galactose and the peptidoglycan are covalently linked by L - rhamnoside - D - N - acetyl - glucosamine - linked disaccharide .

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本文编号：1913460