大鼠骺板软骨细胞体外三维培养及细胞响应力学信号的初步机制

发布时间：2018-05-21 01:16

  本文选题：生长板 + 组织工程　； 参考：《华中科技大学》2011年博士论文

【摘要】：目的： 1.研究大鼠骺板软骨细胞及前软骨干细胞(PSCs)接种壳聚糖/藻酸盐复合多孔支架体外三维培养,探讨其构建组织工程化骺板的可行性。 2.研究动态压应力对体外培养的大鼠骺板软骨细胞外基质以及甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP) mRNA表达的影响。 3.研究动态压应力对体外培养的大鼠骺板软骨细胞Sox9 mRNA及蛋白表达水平的影响,并初步探讨其力学信号转导机制。 4.研究动态张应力对体外培养的大鼠生长板软骨细胞甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)表达的影响,并初步探讨细胞骨架是否参与该力学信号转导过程。 方法： 1.冷冻干燥法制备壳聚糖/藻酸盐复合三维多孔支架；机械分离与酶消化相结合分离骺板软骨细胞；免疫磁珠分选前软骨干细胞(PSCs),诱导其向软骨细胞特性方向分化；细胞接种支架体外三维培养,扫描电镜观察细胞粘附、增殖,MTT评估细胞增殖状况,RT-PCR检测成软骨分化指标,阿辛蓝法测定细胞蛋白多糖(GAG)的合成情况。 2.分离并体外培养大鼠骺板软骨细胞,用自行设计制作的可控细胞压力加载装置对细胞进行不同强度和持续时间的压应力刺激,采用RT-PCR技术分别检测各组软骨特性细胞外基质(Ⅱ型胶原、X型胶原以及aggrecan)以及PTHrP mRNA表达并进行半定量分析。 3.大鼠骺板软骨细胞分组予以动态压应力和钙离子拮抗剂硝苯地平作用24小时。实时定量PCR及Western blot检测分析各组细胞的Sox9 mRNA及蛋白表达情况；细胞行Fluo-3/AM染色,激光共聚焦显微镜(LSCM)观测胞内钙离子荧光强度。 4.免疫磁珠分选骺板前肥大/肥大层软骨细胞,细胞予以不同强度(3%、6%、12%形变)的动态张应力(1Hz)刺激作用24小时,实时定量PCR和Western blot检测各组细胞的PTHrP mRNA和蛋白的表达情况；流式细胞技术检测细胞周期变化。细胞予以一定的张应力刺激和细胞骨架松弛素D (2μM), FITC标记的鬼笔环肽行细胞骨架微丝(F-actin)染色,激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)观测各组细胞骨架形态变化。 结果： 1.采用冷冻干燥法制备的壳聚糖/藻酸盐复合三维多孔支架具有较好的孔径及孔隙率；PSCs体外培养增殖迅速,诱导后的PSCsⅡ型胶原免疫细胞染色及甲苯胺兰、番红O染色阳性；骺板软骨细胞和诱导后的PSCs接种支架后生长良好并分泌细胞外基质,Sox9、Ⅱ型胶原均阳性表达,培养14天后培养液GAG含量两组之间差异无统计学意义(P0.05)。 2.骺板软骨细胞在30 mmHg、60 mmHg、90 mmHg动态压力培养环境下生长良好,各时间点PTHrP、Ⅱ型胶原以及aggrecan mRNA表达水平高于对照组(P0.05)；X型胶原表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。 3.骺板软骨细胞在90mmHg(12kPa)动态压应力下培养24小时后,实时定量PCR结果显示单纯压应力组其Sox9 mRNA及蛋白表达水平明显高于未受力的对照组(P0.05)；添加硝苯地平的压应力组其Sox9表达水平亦高于对照组(P0.05),但低于单纯压应力组(P0.05).LSCM结果显示各组胞内钙离子平均荧光强度差异无统计学意义。 4.动态张应力对骺板前肥大/肥大软骨细胞PTHrP表达的影响呈剂量和时间依赖性,高强度(12%形变)的张应力增加细胞死亡率。强度为6%形变的动态张应力(1Hz)作用24小时明显上调PTHrP表达,LSCM结果显示细胞F-actin在受力后发生重构。细胞骨架松弛素D能部分阻断应力所致的细胞PTHrP表达的上调。 结论： 1. PSCs诱导后向软骨细胞功能方向分化,与壳聚糖/藻酸盐三维多孔支架复合有望用于骺板损伤修复。 2.适当的动态压应力能有效促进体外培养的大鼠骺板软骨细胞Ⅱ型胶原及aggrecan mRNA表达,PTHrP在此细胞力学信号响应过程中可能起重要作用。 3.适当的动态压应力能促进体外培养的大鼠骺板软骨细胞Sox9 mRNA及蛋白的表达,细胞钙离子通道可能参与该力学信号转导过程。 4.动态张应力能影响体外培养的大鼠骺板前肥大/肥大软骨细胞PTHrP mRNA和蛋白的表达水平,细胞骨架参与该力学信号转导过程。
[Abstract]:Objective:
1. the chondrocytes of the epiphyseal plate and the anterior chondrocytes (PSCs) were inoculated with chitosan / alginate composite porous scaffold in vitro, and the feasibility of constructing the tissue engineered epiphyseal plate was investigated.
2. to study the effect of dynamic compressive stress on the extracellular matrix and the expression of parathyroid hormone related protein (PTHrP) mRNA in epiphyseal plate of rats.
3. to study the effect of dynamic compressive stress on the expression of Sox9 mRNA and protein in rat epiphyseal plate chondrocytes in vitro, and to preliminarily explore the mechanism of mechanical signal transduction.
4. the effects of dynamic tensile stress on the expression of parathyroid hormone related protein (PTHrP) in the cultured rat growth plate chondrocytes were investigated, and whether the cytoskeleton was involved in the mechanical signal transduction process was preliminarily investigated.
Method锛，

本文编号：1917081